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製品説明

ISOSPIN Plant RNA

ISOSPIN Plant RNA（アイソスピン プラント RNA）は、植物組織からRNA を抽出・精製するためのキットです。本キットは、カオトロピックイオン存在下でRNA がシリカへ吸着する原理を応用しており、フェノールやクロロホルムを使用しません。使用するスピンカラムは、カラム容積を最大限確保しており、内封されたシリカメンブレンは、充分なRNA 吸着容量と高い溶出効率を確保しています。

本キットでは、夾雑物を遠心分離により除去する方法とシリカメンブレン上でのDNase I 処理を採用しており、約1 時間で高純度のRNA を抽出・精製できます。

Assist Buffer for ISOSPIN Plant RNA

本品は、植物組織からのRNA抽出キット「ISOSPIN Plant RNA」専用のオプションバッファー（補助試薬）です。キットのみでは抽出困難な植物試料からでもISOSPIN Plant RNA のPT-Extraction Buffer に本品を加えるだけで、高収量、高純度なRNAを抽出することができるようになります。

ISOSPIN Plant RNA (with Assist Buffer)

RNA抽出が困難な植物試料（松葉やバラなど）をご使用のお客様に、お求めやすいセット品としてご用意しました。
＜セット内容＞
「ISOSPIN Plant RNA」（50回用）・・・1個
「Assist Buffer for ISOSPIN Plant RNA」（50回用）・・・1個

ISOSPIN Plant RNA (w/o DNase I)

本キットは、「ISOSPIN Plant RNA」 (310-08171) にDNase Iが添付されていない50回用のパッケージです。
冷凍保存（-20℃）が必要な酵素が含まれていないため、本キットは室温で保存が可能です。
別売りのDNase I (RNase free)と組み合わせてご使用ください。

特長

高純度RNA

遠心分離による夾雑物の除去とシリカメンブレン上でのDNase I 処理により高純度なRNA抽出が可能です。

フィルターによる前処理が不要

試料のホモジナイズやろ過を目的としたフィルター処理を必要としません。本キットは遠心分離により夾雑物を沈殿して除去します。

フェノール、クロロホルムが不要

フェノールやクロロホルムなどの毒性有機溶媒は使用しません。

DNase I 添付（※）

DNase I （RNase free）がキットに含まれているため、別途購入の必要はありません。（※添付なしのパッケージもご用意しております）

抽出困難な植物試料（松葉やバラ）にはAssist Buffer添加

いままで困難だったマツ（葉）、バラ（葉、花弁）、ツバキ（葉）、ブドウ（果肉、外皮）などからも効率よくRNA抽出可能です。　（実験例はこちら）

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製品内容

ISOSPIN Plant RNA (50回用)

構成品	容量	保存	備考
PT Extraction Buffer (植物用)	30 ml x 1本	室温
PT Binding Buffer (植物用)	40 ml x 1本	室温	エタノール含有
PT Wash1 Buffer	40 ml x 1本	室温	エタノール含有（洗浄液）
PT Wash2 Buffer	40 ml x 1本	室温	エタノール含有（洗浄液）
DNase I (RNase free)	2,000 units x 1本	-20°C	（※）
10 x DNase I Buffer	1 ml x 1本	-20°C	（※）
ddWater (RNase free)	1 ml x 8本	室温	DNase I 溶液調製用・溶出用
Spin Column	50 本 x 1袋	室温	上部パーツ：カラム、下部パーツ：Collection Tube

ISOSPIN Plant RNA の輸送方法

50回用(Code No. 310-08171)をニッポンジーンから直送する場合、室温品を入れたキット箱と－20°C品とドライアイスを入れたスチロールボックスを一つの段ボール箱にまとめて入れて常温で輸送しています。
※ DNase I が添付されていない、「ISOSPIN Plant RNA（w/o DNase I）」（Code No.315-09581）は室温品を入れたキット箱のみ発送いたします。
200回用(Code No. 316-08173)をニッポンジーンから直送する場合、室温品を入れた50回用のキット箱を4セット分と、冷凍品の4袋を一つのスチロールボックスに入れて、一つの段ボール箱にまとめて梱包しています。

Assist Buffer for ISOSPIN Plant RNA （50 回用）

構成品	容量	保存	備考
Assist Buffer 1	3 ml x 1	室温
Assist Buffer 2	2 ml x 1	室温	Assist Buffer 2 中に白色固形物が生じる場合がありますが、品質、性能に問題はありません。このような場合には、容器ごと37°C程度でインキュベートし、白色固形物を完全に溶解させてからご使用ください。

Assist Buffer for ISOSPIN Plant RNA の使用上の注意

別途、ISOSPIN Plant RNA が必要です。抽出液は用事調製してください。また Assist Buffer 1 と Assist Buffer 2 を混合した状態で保存できません。

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使用例

Data 1.　RNA収量の目安

本品で得られるRNAの収量の目安は次の通りである。

試料

ホウレンソウ（葉）	0.5 μg RNA/mg tissue
ブロッコリー（芽生え）	1.0 μg RNA/mg tissue
キャベツ（種子）	1.3 μg RNA/mg tissue
キャベツ（芽生え）	1.4 μg RNA/mg tissue
キャベツ（葉）	0.1 μg RNA/mg tissue
タケ（葉）	0.3 μg RNA/mg tissue
チューリップ（球根）	0.2 μg RNA/mg tissue

 

Data 2.　シロイヌナズナの葉からのRNA抽出(RNA品質の比較)

Lane ① : A社キットで抽出したRNA
Lane ② : ISOSPIN Plant RNAで抽出したRNA
各100 ngずつ電気泳動in 1% Agarose S

ISOSPIN Plant RNA およびA社RNA抽出キットを用いて、シロイヌナズナの葉から各社プロトコールに従いRNAを抽出した。抽出したRNAの品質を、バイオアナライザ(Agilent Technologies社)によるRIN値の測定、アガロースゲル電気泳動、および吸光度測定により比較した。

結果

ISOSPIN Plant RNAで抽出したRNAは、A社キットで抽出したRNAと比べて、より高品質であることが確認できた。また電気泳動では、各サンプルの吸光度に基づき同じRNA量を泳動しているが、ISOSPINで抽出したRNAはバンドが濃く、高純度であることが示唆された。

Data 3.　シロイヌナズナの根からのRNA抽出(RNA品質の比較)

ISOSPIN Plant RNA およびA社RNA抽出キットを用いて、シロイヌナズナの根から各社プロトコールに従いRNAを抽出した。抽出したRNAは、バイオアナライザ(Agilent Technologies社)を用いたRNA Integrity Number (RIN値) の測定を行った。

結果

ISOSPIN Plant RNA を用いて高品質なRNAを抽出できていることが確認できた。
(RNA量が微量のため、両キット共に吸光度測定や電気泳動での検出はできなかった)

Data 4.　キャベツ（アブラナ科）種子および葉からのRNA抽出

ISOSPIN Plant RNAと他社製品を用いて、プロトコールに従ってキャベツの種子（約4 mg）および葉（約30 mg）からRNAを抽出した。抽出したRNAは、吸光スペクトル測定およびゲル電気泳動により比較した。さらに、抽出したTotal RNAを鋳型に逆転写を行い、得られたcDNAをGeneAce SYBR™ qPCR Mix α Low ROXを用いてリアルタイムqPCRを行った。

実験条件

1. サンプル量
   ・種子（約4 mg）
   ・葉（約30 mg）
2. 変性ゲル電気泳動
   ・ゲル　：1% Agarose S（ホルムアルデヒド変性）
   ・RNA添加量　：種子（1μg）／葉（0.5μg）
   ・RNA Ladder　：RNA添加量と同量
3. リアルタイムqPCR
   ・試薬　：GeneAce SYBR™ qPCR Mix α Low ROX
   ・装置　：ABI 7500 Fast
   ・鋳型cDNA　：抽出したTotal RNAを鋳型に逆転写
   ・増幅鎖長　：441 bp
   ・テスト数　： n=3

結果

吸光度スペクトル測定結果より、ISOSPIN Plant RNAはA社より低いA230の値を示し、多糖類などの夾雑物が効率良く除去できていることが分かった（図1）。

キャベツ種子	キャベツ葉
図1 吸光スペクトル測定
		【RNA添加量】 種子（1μg）／葉（0.5μg） 【Marker】 RNA Ladder(RNA添加量と同量) 1% Agarose S（ホルムアルデヒド変性）
図2 変性ゲル電気泳動
キャベツ種子	キャベツ葉
		【試薬】 GeneAce SYBR™ qPCR Mix α Low ROX 【鋳型】 抽出したTotal RNAを鋳型に逆転写 【装置】ABI 7500 Fast 【増幅鎖長】441 bp 【テスト数】n=3 赤色：　ISOSPIN Plant RNA 緑色：　A社製品
図3 リアルタイムqPCR

 

Data 5.　タケ（イネ科）カルスからのRNA抽出

タケカルス
（ハチク培養細胞Pn(rpc00047)株から形成）

ISOSPIN Plant RNAと他社製品を用いて、プロトコールに従って各量のタケカルスからRNAを抽出した。抽出したRNAは、吸光スペクトル測定およびゲル電気泳動により比較した。さらに、抽出したTotal RNAを鋳型に逆転写を行い、得られたcDNAをGeneAce SYBR™ qPCR Mix α Low ROXを用いてリアルタイムqPCRを行った。

※本実験で使用した竹のカルスは、富山県立大学 荻田信二郎博士（現、公立大学法人県立広島大学）よりご提供頂きました。尚、使用したタケカルスは理化学研究所バイオソースセンターへ委託されたハチク培養細胞Pn（rpc00047）株から形成されたものです。

実験条件

1. サンプル量
   ①約65 mg
   ②約50 mg
   ③約40 mg
2. アガロースゲル電気泳動
   ・ゲル　：0.8% Agarose S／TAE
   ・RNA添加量　：最終溶出量の1/10（5 μl）
   ・Marker　：OneSTEP Marker6（5 μl）
3. リアルタイムqPCR
   ・試薬　：GeneAce SYBR™ qPCR Mix α Low ROX
   ・装置　：ABI 7500 Fast
   ・鋳型cDNA　：抽出したTotal RNAを鋳型に逆転写
   ・増幅鎖長　：197 bp
   ・テスト数　： n=3

結果

吸光度スペクトル測定結果では、ISOSPIN Plant RNAはA社より低いA230の値を示すことから、多糖類などの夾雑物が効率良く除去できていることが分かった（図1）。また、アガロースゲル電気泳動で比較した結果からも、ISOSPIN Plant RNAは効率よくRNAを抽出できていることが確認できた（図2）。

		【ゲル】0.8% Agarose S／TAE 【RNA添加量】最終溶出量の1/10（5 μl） 【Marker】OneSTEP Marker6（5 μl）
図1 吸光スペクトル測定	図2 アガロースゲル電気泳動
	【試薬】GeneAce SYBR™ qPCR Mix α Low ROX 【装置】ABI 7500 Fast 【鋳型cDNA】抽出したTotal RNAを鋳型に逆転写 【増幅鎖長】197 bp 【テスト数】n=3
図3 リアルタイムqPCR

 

Data 6.　チューリップ（ユリ科）球根からのRNA抽出

抽出液の粘性の様子
左：ISOSPIN Plant RNA
右：B社製品

ISOSPIN Plant RNAとB社製品を用いて、プロトコールに従ってチューリップ球根（100 mg）からRNAを抽出した。抽出したRNAは、吸光スペクトル測定およびゲル電気泳動により比較した。さらに、抽出したTotal RNAを鋳型に逆転写を行い、得られたcDNAをGeneAce SYBRR qPCR Mix α Low ROXを用いてリアルタイムqPCRを行った。

チューリップ球根サンプルは粘性が高く、抽出が難しいとされている。右写真は、チューリップの球根を液体窒素ですり潰して粉末状にした後、1.5 mlチューブに量り取り、各社の抽出Buffer中でペッスルにてすり潰した後の様子である。チューブを逆さにして溶液の粘性を比較した。

実験条件

1. サンプル量
   100 mg
2. アガロースゲル電気泳動
   ・RNA添加量　：最終溶出量の1/10（5 μl）

結果

ISOSPIN Plant RNAは粘性の高いチューリップ球根からもRNAを抽出できた。

	最終溶出量の1/10（5 μl）
図1 吸光スペクトル測定	図2 アガロースゲル電気泳動

 

Data 7.　Assist Buffer for ISOSPIN Plant RNA を使用して、杉の葉からのRNA抽出

杉の葉は、粉砕すると粘性物を大量に放出するため、溶液の粘性が高くなりRNA抽出が困難となる。Assist Buffer を組み合わせたISOSPIN Plant RNA オプションプロトコールで、杉の葉 30 mgからRNAを抽出できるか検討した。

実験条件

①　ISOSPIN Plant RNAキット単独の標準プロトコール（製品マニュアル p.3～5参照）
②　本キットとAssist Buffer for ISOSPIN Plant RNA を組み合わせた通常のオプションプロトコール（製品マニュアル p.6~9）
③　TEによる前処理工程後^*1、②の通常オプションプロトコール（製品マニュアルp.6のステップ②注釈、参照）　
　　*1　前処理工程：TE(pH8.0)中でペッスルで軽くすり潰し、遠心分離（13,000 x g、4℃、10分）を行う。
④　TEによる前処理工程後^*1、②のオプションプロトコール、洗浄工程を改変^*2（製品マニュアルp.7のステップ⑲、参照）　
　　*2　PT Wash2 Buffer で 600 μl x 1回洗浄するところ、300 μl x 2回に変更。

結果

スギの葉は、キットのみでは抽出困難だったが、Assist Buffer for ISOSPIN Plant RNA を組み合わせたオプションプロトコールを行うことでRNA抽出可能だった。また、TEによる前処理工程や、改変して洗浄工程を加えることでより高純度なRNAを抽出できた。

Data 8.　「ISOSPIN Plant RNA」と「Assist Buffer for ISOSPIN Plant RNA」の併用によりRNA抽出効率の改善

RNA抽出が困難な植物組織から、「ISOSPIN Plant RNA」のみ、または「ISOSPIN Plant RNA」と「Assist Buffer forISOSPIN Plant RNA」を併用してRNA抽出を行い、抽出したRNA溶液の吸光スペクトルを比較した。

結果

「ISOSPIN Plant RNA」だけではRNA抽出が困難な植物組織において、「Assist Buffer for ISOSPIN Plant RNA」と併用することにより、RNAの収量や純度を改善することができた。

効果が確認された植物組織

「ISOSPIN Plant RNA」と「Assist Buffer for ISOSPIN Plant RNA」の併用によりRNA抽出効率の改善が確認された組織。

*1. 「ISOSPIN Plant RNA」のみでは抽出が困難な植物組織.
*2. イチゴ(葉)はAssist Bufferの添加比率を変更することでより高純度なRNAが得られます。詳細は以下Q＆Aをご覧ください。

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Q & A

　

イチゴの葉からのRNA抽出において、純度を改善したい。

別売りの「Assist Buffer for ISOSPIN Plant RNA」（Code No.315-08501）の添加比率を変更することで高純度なRNAが得られることを確認しています。イチゴの葉においては、500 μlのPT Extraction Buffer （植物用）に10 μlのAssist Buffer 1 と40 μlのAssist Buffer 2を加えて混和し、550 μlの抽出液を調製してください（以降はマニュアルに従う）。

オプションプロトコールの前処理で「夾雑物が多い試料はTEを加え、軽くすり潰す」とありますが、軽くとはどの程度ですか？

前処理のために植物試料にTEを加えて軽くペッスルですりつぶす際、破砕してバラバラになりますとRNAが分解しRNA収量低下の原因となります。 葉が破砕されない、葉の色が深く変わる程度を目安にしていただくことをお勧めいたします。 すり潰すようにペッスルを動かすと、葉が千切れてしまうため、軽く押さえるようにして、葉の表面だけ洗います。

RNA抽出効率が悪い場合の改善方法はありますか。

試料のホモジナイゼーションまたは溶解が不十分だと、PT Extraction Buffer (植物用) に触れていない細胞内部でのRNA分解が進みます。
組織の摘出を素早くすることと、効果的にホモジナイズすることが重要です。
参考資料 各種試料のホモジナイズ方法

ISOSPIN Plant RNAで抽出したRNAをRNA-seq解析に使用した実績はありますか？

東京大学植物病理学研究室の以下論文にて、RNA-seq解析のRNA抽出に本キットをご使用頂いております。
Tokuda R, Nishikawa M, Hosoe N, Nijo T, Iwabuchi N, Yoshida T, Watanabe K, Maejima K, Yamaji Y, Namba S. (2019) Complete Genome Sequence of a Carrot Torradovirus 1 Isolate, Obtained from Angelica. Micorobiology. 8 (15): e00110-19

植物試料からmiRNAを抽出した実績はありますか？

ISOSPIN Plant RNA（本品）で植物からmiRNAを抽出した実績はございません。
本品の原理上、miRNAを効率よく回収することが難しいと考えられます。
一方で、ISOSPIN Liquid Sample miRNA 、ISOGEN with Spin Column、ISOGENでは、シロイヌナズナ、茶葉からmiRNAの抽出実績があります。
ISOSPIN Liquid Sample miRNAを用いた植物試料（シロイヌナズナ、茶葉）からのmiRNA抽出実験例はこちら

得られたRNA溶液について、再度DNase処理とカラム精製を行う方法はありますか。

得られたRNA溶液に対してDNase処理を行います。
DNase処理を行ったサンプルはプロトコールの最初から行うことで精製することができます（この時メンブレン上でのDNase 処理は必要ありません）。

1. 例えば、抽出したRNA溶液 50 µLに対して、10 μlの10×DNase I Buffer、2.5 μlのDNase I (RNase free)を加えて約60 μlの反応系にし、37℃で15分間のDNase処理を実施します。
2. DNase処理を行った後のRNA溶液（60 μl～上限100 μl）に対して、600 μlのPT Extraction Buffer (植物用) を加えて混合し遠心します。
3. 回収した上清と等量（例では 660 μl）のPT Binding Buffer (植物用)を加え混和したあと、600 μlずつ2回に分けてSpin Columnに全量を添加します。
4. 500 μlのPT Wash1 Bufferを添加して洗浄します（省略可能です）。 （DNaseI処理は省略します）
5. 300 μlのPT Wash1 Bufferを添加して洗浄します（省略可能ですが、よく精製したい場合は実施します）。
6. 600 μlのPT Wash2 BufferをSpin Columnに添加して洗浄したあと、カラムをチューブの上に移します。
7. 50 μlのddWater (RNase free)をメンブレン中央に滴下してRNAを溶出します。

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資料 Data Sheet

製品マニュアル

• ISOSPIN Plant RNA　詳細マニュアル（PDF・WEB版）
• ISOSPIN Plant RNA　製品説明書（PDF・製品添付版）
• Assist Buffer for ISOSPIN Plant RNA　製品添付書（PDF）（使用方法の詳細は、「ISOSPIN Plant RNA マニュアル」をご覧ください）
• ISOSPIN Plant RNA (w/o DNase I)　製品説明書（PDF・製品添付版）

SDS(Safety Data Sheet)

• ISOSPIN Plant RNA　製品安全データシート(PDF)
• Assist Buffer for ISOSPIN Plant RNA　製品安全データシート(PDF)
• ISOSPIN Plant RNA (w/o DNase I)　製品安全データシート(PDF)

リーフレット

• 植物試料からの核酸抽出キット（PDF）
• ISOSPIN Plant RNA　パンフレット2ページ目（PDF）
• ISOSPIN Plant RNA (w/o DNase I)　パンフレット2ページ目（PDF）
• RNA抽出、cDNA合成キット、リアルタイムPCR試薬　パンフレット（PDF）

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関連情報

備考

• 本品は試験研究用試薬です。医薬品の用途には使用しないでください。

参考文献

1. Tokuda R, Nishikawa M, Hosoe N, Nijo T, Iwabuchi N, Yoshida T, Watanabe K, Maejima K, Yamaji Y, Namba S. (2019) Complete Genome Sequence of a Carrot Torradovirus 1 Isolate, Obtained from Angelica. Micorobiology. 8 (15): e00110-19

関連製品

• ISOSPIN Plant DNA（植物からのDNA抽出キット）
• DNase I (RNase free)
• Collection Tube（コレクションチューブの単品パッケージ）
• ISOPLANT（植物、細菌、酵母からのDNA抽出キット）
• ISOPLANT II（植物、細菌、酵母からのDNA抽出キット）
• ISOSPIN Cell & Tissue RNA （動物細胞、動物組織用からのRNA 抽出）
• ISOSPIN Plasmid （大腸菌からのプラスミド抽出）
• ISOSPIN PCR Product （PCR産物の精製）
• ISOSPIN Agarose Gel （アガロースゲルからのDNA精製）
• ISOSPIN Blood & Plasma DNA （血液、血清、血漿からのDNA抽出）
• ISOSPIN Fecal DNA （糞便からのDNA抽出）

問い合わせ先

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