GeneAce Reverse Transcriptase

M-MLV由来の逆転写酵素 改変型(RNase H- )
品名 Code No. 包装単位 価格 備考
GeneAce Reverse Transcriptase 316-08151 10,000 units 20,000円  
GeneAce Reverse Transcriptase 312-08153 10,000 units x 5 80,000円  

製造元 (株)ニッポンジーン

表示価格は希望納入価格 (税別) です。

製品説明

本品は、Moloney Murine Leukemia Virus(M-MLV;マウス白血病ウイルス)由来の改変型(RNase H-) の逆転写酵素で、大腸菌で発現・精製した組換え酵素です。改変型は点変異によりRNase H活性を欠損させています。RNase H 活性はDNA- RNAハイブリッド二本鎖のRNAを分解する活性で、RNase H 活性を欠損させることで完全長cDNAの合成効率が向上します。

※ M-MLV由来の野生型(RNase H+)の逆転写酵素 M-MLV Reverse Transcriptase はこちら

特長

・M-MLV由来の改変型(RNase H-)逆転写酵素・完全長cDNAの合成効率が向上・熱安定性が向上・高温反応によりRNAの二次構造による影響を回避・GeneAce qPCR Mix α(リアルタイムqPCR試薬)との組み合わせに最適

用途

起源 遺伝子組換え大腸菌
活性 200 units/µl
単位の定義 1 unit は、37°Cで10 分間に1 nmol のdTTPを酸不溶性画分に取り込ませる酵素活性とする。
形状 GeneAce Reverse Transcriptase:
20 mM Tris-HCl (pH7.5), 200 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 50% Glycerol, 0.05% NP-40, 0.05% Tween20
5 x RT Buffer:
250 mM Tris-HCl (pH8.3), 375 mM KCl, 15 mM MgCl2, 50 mM DTT

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製品内容

GeneAce Reverse Transcriptase(10,000 units
構成品 容量 保存 備考
GeneAce Reverse Transcriptase 50 µl x 1 -20°C  
5 x RT Buffer 1 ml x 1 -20°C 5 x RT Buffer に白い沈澱が析出している場合は、室温でボルテックスミキサー等で混和し、完全に均一にしてからご使用ください。

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使用例

実験例1 cDNA合成効率の比較

マウスFM3A細胞 total RNA 2 µgを鋳型として、Oligo (dT) primerとGeneAce Reverse Transcriptase、A社製品、B社製品(各社RNaseH-改変型)を用いてそれぞれ逆転写反応を行った。その後、合成したcDNAを鋳型にして、GeneAce SYBR® qPCR Mix α Low ROXを用いて定量PCRを行った。
合成した各cDNAを鋳型として定量PCRによりβ-actin遺伝子を検出し、増幅の立ち上がりの早さを比較した。

結果

GeneAce Reverse Transcriptaseで合成したcDNAは、増幅曲線の立ち上がりが早く、cDNAの合成効率が高いことが示された。

実験例2 長鎖cDNA(10 kb)の合成効率の比較

マウスFM3A細胞 total RNA 2 µgを鋳型として、Oligo (dT) primerとGeneAce Reverse Transcriptase、A社製品、B社製品(各社RNaseH-改変型)を用いてそれぞれ逆転写反応を行った。その後、合成したcDNAを鋳型にして、GeneAce SYBR® qPCR Mix α Low ROXを用いて定量PCRを行った。
合成したcDNAを鋳型に、Utrophin遺伝子(NM_011682, 12382 bp)を定量PCRによりcDNA量を比較した。定量PCR primerは3’末端から約10 kb付近に設計した。

結果

GeneAce Reverse Transcriptaseは、約10 kbpの長鎖cDNAの合成効率が高いことが示された。

実験例3 長鎖cDNA(10 kb)の合成 (実際の反応例)

Total RNAの抽出→逆転写反応→リアルタイムPCR

  1. ISOSPIN Cell & Tissue RNA を使用して、マウス腎臓組織 9.1 mg から total RNA 15 μg を抽出した。
  2. 得られた total RNA 2 μgを鋳型に GeneAce Reverse Transcriptase を用いて 1st strand cDNA を合成した。
  3. cDNA溶液を鋳型に、Utrophin mRNA の3'側から約10 kb の領域を増幅するプライマーを用いてリアルタイムPCRを行った(GeneAce SYBR® qPCR Mix α Low ROXを使用)。
逆転写反応系
50 μM Oligo dT(20) Pirmer 1 μl  
10 mM dNTPs 1 μl
total RNA + ddH2O up to 15μl
↓ RNA変性: 65°C 5分、On ice
5 X RT Buffer 4 μl  
GeneAce Reverse Transcriptase 1 μl
↓ 逆転写反応: 42°C 50分
↓ 熱失活: 70°C 15分
1st strand cDNA 溶液 (反応液量 20 μl)  

反応液組成
2x GeneAce SYBR® qPCR Mix α Low ROX 12.5 μl (final conc. 1X)
1.25 mM each Primers 10 μl  
40倍希釈したcDNA溶液 1.25 μl  
ddH2O up to 25 μl  

PCR条件
95°C 10分 酵素活性化ステップ  
95°C 30秒 40サイクル
59°C 1分
融解曲線解析

結果

GeneAce Reverse Transcriptaseを用いて、cDNA 10 kbpの合成を確認できた。

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資料 Data Sheet

製品マニュアル

SDS(Safety Data Sheet)

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関連情報

備考

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問い合わせ先

購入に関するお問い合わせ先
富士フイルム和光純薬株式会社および同社代理店・特約店
製品に関するお問い合わせ先
株式会社ニッポンジーン 学術営業課

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