T4 Polynucleotide Kinase

修飾酵素
品名 Code No. 包装単位 価格 備考
T4 Polynucleotide Kinase 312-01551 1,000 units 13,000円  

製造元 (株)ニッポンジーン

表示価格は希望納入価格 (税別) です。

製品説明

T4 Polynucleotide Kinase は、ポリヌクレオチド5´- OH 末端へ、ATP のγ位りん酸を転移する反応を触媒する酵素です。DNA やRNA の5´末端の標識や合成DNA の5´末端のりん酸化に用いられます。本品はT4 ファージのpseT gene をプラスミドにクローン化して得た高生産株の大腸菌より精製しています。なお、りん酸化に必要な反応専用バッファー(3種類)を添付しています。

起源 Escherichia coli JM109-(pKS-PNK7)
活性 5 ~ 20 units/µl
単位の定義 1 unit は、Micrococcal nuclease で処理した仔牛胸腺DNA を基質として、37°C、pH 7.6 において30 分間に1 nmol の[γ-32P]ATP を酸不溶性沈殿物に取り込む活性とする。
形状 50 mmol/l KCl, 10 mmol/l Tris-HCl(pH 7.4), 0.1µmol/l ATP, 0.2 mg/ml BSA, 50%(v/v)Glycerol
酵素反応条件 10 x Kinase Buffer A を用いる場合:
50 mmol/l Tris-HC(l pH 7.6), 10 mmol/l MgCl2, 5 mmol/l DTT, 0.1 mmol/l Spermidine,0.1 mmol/l EDTA, 37°C
5 x Kinase Buffer B を用いる場合:
50 mmol/l Imidazole-HC(l pH 6.4), 18 mmol/l MgCl2, 5 mmol/l DTT, 6%(w/v)PEG6000, 37°C
5 x Kinase Buffer C を用いる場合:
50 mmol/l Imidazole-HC(l pH 6.4,) 18 mmol/l MgCl2, 5 mmol/l DTT, 0.1 mmol/l Spermidine,0.1 mmol/l EDTA, 0.1 mmol/l ADP, 1 nmol/l ATP, 4.8%(w/v)PEG6000, 37°C
添付の反応専用バッファー(3 種類A、B、C 各1 ml x 1 本)は酵素反応条件のA は10 倍、B、C は5 倍の濃度である。例えば反応容量が50 µl の場合には、A は5 µl、B、C は10 µl を加える。
純度 本酵素20 units と1 µg のλ/Hind III フラグメントを37°Cで24 時間反応させてもDNA のアガロースゲル電気泳動パターンに変化は認められない。
本酵素20 units と1 µg の基質RNA を37°Cで24 時間反応させてもRNAのアガロースゲル電気泳動パターンに変化は認められない。

 

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製品内容

T4 Polynucleotide Kinase(1,000 units)
構成品 容量 保存 備考
T4 Polynucleotide Kinase 1,000 units -20°C  
10 x Kinase Buffer A 1 ml -20°C 添付反応バッファーは、酵素反応条件の10倍濃度です。
5 x Kinase Buffer B 1 ml -20°C 添付反応バッファーは、酵素反応条件の5倍濃度です。
5 x Kinase Buffer C 1 ml -20°C 添付反応バッファーは、酵素反応条件の5倍濃度です。

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使用例

l. りん酸転移反応

(あらかじめ基質を脱りん酸化しておく必要がある)
DNA やRNA の5′末端OH 基にりん酸基を付加する反応の効率は、一般に次のような順である。
①一本鎖末端>②二本鎖5′突出末端>③二本鎖平滑末端>④二本鎖3′突出末端

proto-1 proto-2

反応例1 の方法を行って反応効率が低い場合には、反応例2 の方法を試してみる。

ll. りん酸交換反応 注3)

この方法は、基質DNA をあらかじめ脱りん酸化しなくてよいので、便利である。

proto-3

注1) 脱りん酸化DNA は、カラムクロマトグラフィー(Sepharose CL-4B など)などで、低分子量の核酸を取り除いておかねばならない。また、T4 Polynucleotide Kinase は、アンモニウムイオンで強く阻害されるので、アンモニウム塩を含む溶液中のDNA やアンモニウム塩を加えてエタノール沈殿したDNA を基質に用いてはいけない。
注2) 1 pmol の5′末端とは、二本鎖DNA の場合、100 塩基対が3.3 x 10-2 µg に相当し、1,000 塩基対が3.3 x 10-1 µg に相当する。
注3) りん酸交換反応は、りん酸転移反応と比較してその効率が1/5 ~ 1/10 に低下する。

実験例1 PCR産物のリン酸化

PCR 産物のリン酸化には、プライマーをリン酸化してからPCR に使用する方法(一本鎖末端)と、PCR 産物をリン酸化する方法(二本鎖平滑末端、二本鎖3′突出末端)のどちらかになりますが、リン酸化反応は二本鎖末端よりも一本鎖末端の方が効率良く行えます。

data1

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技術情報

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株式会社ニッポンジーン 学術営業課

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