dA-overhang reaction Mix

dA付加反応試薬
品名 Code No. 包装単位 価格 備考
dA-overhang reaction Mix 313-08781 25 µl(25回用) 13,000円

製造元 (株)ニッポンジーン

表示価格は希望納入価格 (税別) です。

製品説明

Go-to DNA Polymerase」等のα型の高正確性PCR酵素は、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性(校正活性)を有するため、得られるPCR産物は平滑末端です。 このPCR産物をTAクローニングするためには、3’末端にdAを付加する必要があります。

本品は、平滑末端のPCR産物にdAを簡便に付加するための10 x 反応液です。 本品でdAを付加したPCR産物は、そのままTAクローニングに用いることができます。

特長

平滑末端のPCR産物にdAを付加 反応は65℃で10分間のみ dAを付加したPCR産物はそのままTAクローニングに使用可能

用途

▲このページのトップへ

製品内容

使用回数

25回用(10 μl反応系での使用回数です。)

dA-overhang reaction Mix
構成品 容量 保存 備考
dA-overhang reaction Mix 25 µl -20°C 10 x 反応液

▲このページのトップへ

使用例

I. インサートDNA の調製

  1. α 型PCR 酵素「Go-to DNA Polymerase」等を用いて、目的の配列を増幅します。
  2. 反応液の一部をアガロースゲル電気泳動に供して、増幅産物の確認を行います。
  3. 精製キット「ISOSPIN PCR Product」または「ISOSPIN Agarose Gel」等を用いて、PCR 産物の精製を行います。

II. dA 付加反応

  1. 新しいチューブに以下の比率で反応液を調製し、良く混合して下さい。
    反応液組成
    dA-overhang reaction Mix 1 μl
    精製したPCR 産物 9 μl
    Total 10 μl
  2. 反応液を65℃で10 分間反応させます。
  3. 反応液は、そのままライゲーションに用いることができます。(dA 付加反応は、ライゲーションの直前に行うようにして下さい。)

実験例1 dA付加反応の有無によるTAクローニングの効率比較

α型高正確性PCR酵素である「Go-to DNA Polymerase」で増幅した平滑末端のPCR産物(3 kb)を「dA-overhang reaction Mix」によりdA付加し、「TA-Enhancer Cloning Kit」を用いてTAライゲーション反応を行った。反応後、「ECOSTM Competent E. coli JM109」へ形質転換した。dA付加反応をしていないPCR産物をコントロールとして、コロニー数を計測して比較した。

結果

本品でdA付加したPCR産物を効率よくTAクローニングすることができた。

▲このページのトップへ

Q & A

反応液をすぐライゲーションに用いましたが、効率が悪いです。

「TA-Enhancer Cloning Kit」を用いる場合の調製例

1. インサート DNA の調製:精製したPCR 産物の一部を ddWater または TE(pH8.0)で適した濃度に希釈します。

インサートDNAの長さ 20 µlの系でpANT Vector(2.7 kbp, 25 ng/µl)を1.8 µl使用した場合
500 bp 46 ng/μl(pANT Vector とのモル比を1:5にするため)
1 kbp 37 ng/μl(pANT Vector とのモル比を1:2にするため
3 kbp 55 ng/μl(pANT Vector とのモル比を1:2にするため)

2. dA付加反応液を調製(Total 10 μl:dA-overhang reaction Mix 1 μl, 希釈済み精製PCR産物 9 μl)、65℃で10 分間反応させます。

3. 以下の内容でライゲーション液(Total 20 μl)を調製します。

pANT Vector (25 ng/µl) 1.8 μl (final conc. 45 ng/20 μl)
5 x Ligation Mix  4 μl (final conc. 1X)
10 x Enhancer Solution 2 μl (final conc. 1X)
Insert DNA(dA付加反応液) 1 μl  
d.d. Water 11.2 μl (Total 20 μlにする)

添加する10 x Enhancer Solution の量は正確にはかりとって下さい。推奨量より多く添加したり、少なく添加したりするとライゲーション効率が著しく低下する場合があります。

4. ライゲーション反応液を 16°C で 30 分間反応させます。

▲このページのトップへ

資料 Data Sheet

製品マニュアル

SDS(Safety Data Sheet)

リーフレット

▲このページのトップへ

関連情報

備考

関連製品

購入に関するお問い合わせ先
富士フイルム和光純薬株式会社および同社代理店・特約店
製品に関するお問い合わせ先
株式会社ニッポンジーン 学術営業課

ページトップ