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Cas9 Nuclease protein NLS

Cas9 ヌクレアーゼ プロテイン NLS
ゲノム編集
品名 Code No. 包装単位 価格 備考
Cas9 Nuclease protein NLS (3 µg/µl) 319-08641 75 µg 23,000円 ライセンス
Cas9 Nuclease protein NLS (15 µg/µl) 316-08651 300 µg 75,000円 ライセンス

製造元　（株）ニッポンジーン

表示価格は希望納入価格 (税別) です。

製品説明


Cas9 Nuclease ニッポンジーン

本品は、Streptococcus pyogenes 由来のCas9 ヌクレアーゼを、組換え大腸菌で発現・精製したものです。核移行シグナル (nuclear localization sequence: NLS) を有しており、合成したガイドRNA (gRNA) と組み合わせることでゲノム編集に利用することができます。

ゲノム編集は、細胞の核の中でゲノムDNAの塩基配列を改変する技術です。RNA誘導型ヌクレアーゼであるCas9 タンパク質は、gRNAと相補的に結合した任意のDNA配列を二重鎖切断 (DSB: double-strand break) し、DNA損傷修復機構を利用して遺伝子変異を引き起こすことができます。

特長

・15 μg/μlの高濃度品をラインナップに追加！→実験例：エレクトロポレーションによるヒトiPS細胞への導入
・生産効率を上げて低価格を実現
・高純度・高品質のCas9 Nuclease タンパク質
・核移行シグナル (NLS) を付加
・低エンドトキシン (1 EU/μg 未満)

起源 遺伝子組換え大腸菌
酵素形状 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 300 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 50％ Glycerol
備考 1 EU/μg 未満 （ゲル化比濁法によるエンドトキシン試験）

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製品内容

Cas9 ヌクレアーゼ プロテイン NLS （3 µg/µl）
構成品 容量 保存 備考
Cas9 Nuclease protein NLS (3 µg/µl) 75 µg x 1本 -20°C 75 µg (468.8 pmol)
濃度： 3 μg/μl
Cas9 ヌクレアーゼ プロテイン NLS （15 µg/µl）
構成品 容量 保存 備考
Cas9 Nuclease protein NLS (15 µg/µl) 300 µg x 1本 -20°C 300 µg (1875 pmol)
濃度： 15 μg/μl

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使用例

使用例1　in vitro での切断チェック

反応液組成
Cas9 Nuclease protein NLS (約1-2 pmol) 150 - 300 ng  
tracrRNA (2 μM) 1 μl  
crRNA (2 μM) 1 μl  
　室温　5 分間
基質DNA 100 ng  
10 x H buffer *1 2 μl  
d.d.H2O up to 20 μl  

37°C、60 分間

Loading Buffer (SDS含有)*2 を添加し、 65°C、5 分間

アガロースゲル電気泳動

*1　10X H Buffer 組成：500mM Tris-HCl (pH 7.9), 1M NaCl, 100mM MgCl2, 10mM DTT
*2　正確な泳動結果を得るため、SDSを含むLoading Buffer（Code No. 313-90111）などを使用

使用例2　ヒトiPS細胞の遺伝子ノックイン

Cas9 Nuclease protein NLS （15 µg/µl）を使用し、エレクトロポレーション（EP）法でヒトiPS細胞201B7株へ導入し、ノックイン細胞株を作製した。 ノックインには、標的遺伝子XXにある制限酵素HindIIIサイトの中にEcoRIサイトを付加した150 nt のノックインドナーDNA（一本鎖オリゴヌクレオチド：ssODN）を使用した。

エレクトロポレーション法（EP）でトランスフェクション

装置： 4D-Nucleofector （Lonza）
細胞数：　0.5 x 106 cells/EP
使用製品：　Cas9 Nuclease protein NLS （15 µg/µl） 100pmol
セレクション：　限界希釈・ピックアップ


図1　エレクトロポレーション・限界希釈後のシングルクローン細胞株のスクリーニング（ホモKIサンプル例）

全アレルノックイン（ホモKI）候補サンプル例

ゲノム編集により、制限酵素HindIIIサイトがある標的配列にノックアウト（KO）、ノックイン（KI）などの遺伝子変異が生じると、HindIIIでは切断されない。

ssODNには制限酵素EcoRIサイトを付加しているため、ssODNによるノックイン（KI）に成功すると、EcoRIによって切断されるバンドが生じる。

したがって、左図において両アレルノックイン（ホモKI）候補は、6、16、21レーンのサンプルである。

表1　シングルクローン細胞株のスクリーニング結果

WT：全アレル野生型
1KO：1アレル以上ノックアウト
1KI：ノックインと野生型のアレル混在もしくはノックイン、ノックアウトと野生型アレル混在
2KO：全アレルノックアウト（ホモKO）
1KO, 1KI：ノックアウトとノックインのアレル混在
2KIΔ：全アレルノックイン（ホモKI）または1KO, 1KI の可能性あり
2KI：全アレルノックイン（ホモKI）

iPS細胞ノックイン細胞株のシークエンス解析

野生型配列とのアラインメント

両アレルノックイン（ホモKI）候補サンプルの変異領域についてシークエンス解析を行い、ノックイン細胞株であることを確認した。

野生型アレルの制限酵素HindIIIサイト（AAGCTT）配列の中に、制限酵素EcoRIサイト（GAATTC）がノックインされている。

結果

Cas9 Nuclease protein NLS （15 µg/µl）　を用いて、ヒトiPS細胞のノックイン細胞株（EcoRIサイト導入）を得ることができた。

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使用例3　Cas9 Nuclease protein NLS (3 µg/µl) を用いたノックインマウスの作出

マウスSmpd3 遺伝子を標的として、本品とgRNAおよびノックインドナーDNA（一本鎖オリゴヌクレオチド：ssODN）を混合し、C57BL/6Jマウス受精卵の前核と細胞質にマイクロインジェクションした。マウス 2細胞期胚を仮親に移植し、誕生した仔マウスについて遺伝子ノックインの有無を確認した。

user-provided data01

A）Surveyorアッセイによる変異導入（ノックアウト）の確認

Surveyor assay (Cel-I ヌクレアーゼアッセイ) では、Cas9 の導入によりノックアウト、ノックインなどの遺伝子変異が導入された改変体個体をバンドシフトによりスクリーニングすることができる。本実験では、誕生した仔マウス11匹のうち6匹のサンプルにおいて、Cel-Iヌクレアーゼにより切断されたPCR産物が観察された（矢印, 下左図）。

B) PCR-RFLPによる変異導入（ノックイン）の確認

ドナーDNA（ssODN）に予め制限酵素（BamHⅠ）サイトを付加した。得られたPCR産物をBamH I で消化したところ、Surveyor assay で陽性検出された変異体候補サンプルで、切断断片が観察された（矢印, 下右図）。

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結果

誕生した11匹の仔マウスのうち 6匹のマウスにおいて遺伝子ノックインが確認された。このことから、Cas9 Nuclease protein NLS を用いて効率良く遺伝子ノックインを行えたことが分かった。

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資料 Data Sheet

Cas9 Nuclease ニッポンジーン

製品マニュアル

SDS(Safety Data Sheet)

リーフレット

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富士フイルム和光純薬株式会社および同社代理店・特約店
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