ISOGEN、ISOGEN-LS
RNA抽出用試薬ISOGEN／ISOGEN-LSを用いた酵母からのRNA抽出
酵母は厚い細胞壁を持つため、通常のISOGEN/ISOGEN-LS処理のみで、RNAを効率良く回収するのは困難です。そこで、β-1,3結合のグルコースポリマーに作用するZymolyaseを用いて細胞壁を溶解し、RNA抽出を試みました。また、Zymolyase処理の有無を比較することでその効果を検証しました。
プロトコール
| yeast（1.5ml culture） | ||
| ↓ 遠心分離（5k x g、4°C、5分間） | ||
| 沈殿 | ||
| ↓ ←TE 1 ml | ||
| ↓ Vortex | ||
| ↓ 遠心分離（5k x g、4°C、5分間） | ||
| 沈殿 | ||
| ↓ ←Buffer A*1 200 µl | Zymolyase処理無しの対照実験では、黄色で示した操作を省く。 | |
| ↓ Vortex | ||
| ↓ ←Zymolyase-20T （1,000U/Buffer A 1 ml） 20 µl | ||
| ↓ インキュベート（30°C、30分間） | ||
| ↓ 遠心分離（5k x g、4°C、10分間） * ISOGEN-LS の場合は省略 | ||
| 沈殿 * ISOGEN-LS の場合は省略 | ||
| ↓ ←ペレットにISOGEN 1 mlまたは 溶液 220 µl に ISOGEN-LS 750 µl添加 | ||
| ↓ 放置（室温、5分間） | ||
| ↓ ←Chloroform 200 µl | ||
| ↓ 強く撹拌（15秒間） | ||
| ↓ 放置 （ 室温、 3 分間 ） | ||
| ↓ 遠心分離 （12k x g 、 4°C 、 15 分間 ） | ||
| 水層 （500 µl） | ||
| ↓ ←Isopropanol 500 µl | ||
| ↓ 放置（室温、5-10分間） | ||
| ↓ 遠心分離（12k x g、4°C、10分間） | ||
| 沈殿 | ||
| ↓ ←70% Ethanol 1 ml | ||
| ↓ Vortex | ||
| ↓ 遠心分離（7.5k x g、4°C、5分間） | ||
| 沈殿 | ||
| ↓ 乾燥 | ||
| ↓ ←TE 100 µlに溶解 | ||
| Total RNA溶液 | ||
*1 Buffer A : 1M sorbitol, 100mM EDTA, 14mM 2-Mercaptethanol
結果
上記のプロトコールで抽出したTotal RNAの電気泳動結果は下記の通り。
1% ホルマリン変性アガロースゲル
100V、40分間泳動
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