Ethachinmate

アルコール沈殿用共沈剤（DNase，RNaseフリー）

Real-time PCR におけるEthachinmate の影響について

Ethachinmate が定量PCR の結果に影響を与えるかどうか確認した。

実験条件

18S rRNA Control Kit (FAM-TAMRA) （Eurogentec：RT-CKFT-18S）を使用し、以下の条件でReal-timePCR を行った。
     
 
Template：　
30 ng/µl Human chromosomal DNA（30,000 pg、3,000 pg、300 pg、30 pg）
 
Primer：　
 18S primer mix（final 300nM）
 
Probe：　
 18S FAM-TAMRA probe (final 100nM)
 
定量PCR 試薬：　
 qPCR Mastermix Plus Low ROX（Eurogentec）
 
PCR volume：　
 20 µl
 
装置：　
 ABI 7500 Fast Real-Time PCR System
 
PCR condition：　
 95°C 10 min.→（95°C 15 sec.→60°C 1 min.） x 40
     
 
条件①：　
 キット付属のTemplate を希釈した。 
 
条件②：　
 Template 100 µl に2 µl のEthachinmate を添加してエタノール沈殿を行い、100 µl のTEに溶解して①と同様に希釈した。 
 
条件③：　
 ①と同じTemplate を使用した。ただし、反応系につき1 µl のEthachinmate を添加した。 

 

結果

図1．Amplification plot（増幅曲線）
 
Ethachinmate を添加した条件②および③とEthachinmate 未添加の条件①を比較したところ、得られたAmplification plot（図１）にはほぼ差が認められず、いずれのTemplate 濃度においても同様の増幅が確認された。
図2．検量線
 
各条件の検量線の傾き（図2）もほぼ同じと判断された。条件③は、PCR 反応液（20 µl）にEthachinmate 1 µl を添加しており、通常想定されるEthachinmate の使用方法から考えると、持ち込み量が極めて多い条件となっている。この条件③においても、条件①との傾きの差は極めて小さかった。

鋳型となる核酸の精製にEthachinmate を使用した場合においても、Real-time PCRに与える影響は極めて少ないか、ほとんどないと考えられる。また、条件①と②の差がほとんどないことから、Ethachinmate による効率の良い核酸回収能力も確認された。

 


1. 微量核酸の回収
2. 酵素反応に及ぼす影響
3. Transformation, in vitro packaginigに及ぼす影響
4. モノヌクレオチドの挙動
5. Poly(A)+ RNAの回収（エタノール沈殿の際のEthachinmateの効果）
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