Gene RED PCR Mix Plus

2色のDye入り 2ｘプレミックスタイプPCR試薬

品名	Code No.	包装単位	価格
Gene RED PCR Mix Plus	315-07761	48回用	5,600円
Gene RED PCR Mix Plus	311-07763	96回用	8,600円
Gene RED PCR Mix Plus	319-07764	960回用	67,000円

製造元　（株）ニッポンジーン

表示価格は希望納入価格 (税別) です。

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製品説明

Gene RED PCR Mix Plus は、2 x プレミックスタイプのPCR 試薬です。PCR に必要なTaq DNA Polymerase、dNTPs、Mg²⁺などを含むため、鋳型DNA とプライマーを加えるだけでPCR ができます。また、本品にはあらかじめ比重調整剤と色素が含まれているため、PCR 後の反応液はそのまま電気泳動ゲルにアプライすることができます。
本品は、高速PCR にも対応できるようバッファー組成を最適化しています。比較的GC リッチな配列や長鎖（10kb）も増幅することができ、得られたPCR 産物はTA クローニングに使用可能と、幅広い実験に対応しています。

特長

・簡単操作の2 x プレミックスタイプ・高速反応が可能（伸長時間10秒/kb）・2色のDye入りで、そのままアプライ可能・様々なサンプルに対応

用途

コロニーPCR
インサート確認等

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製品内容

使用回数

包装単位は50 µl反応系で25 µl使用する場合の使用回数です。

Gene RED PCR Mix Plus （48回用）
構成品	容量	保存	備考
Gene RED PCR Mix Plus（2X）	1.2 ml x 1	-20°C

Gene RED PCR Mix Plus （96回用）
構成品	容量	保存	備考
Gene RED PCR Mix Plus（2X）	1.2 ml x 2	-20°C

Gene RED PCR Mix Plus （960回用）
構成品	容量	保存	備考
Gene RED PCR Mix Plus（2X）	1.2 ml x 20	-20°C

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使用例

反応液組成
Gene RED PCR Mix Plus	25 µl
Primer-forward（10 µM）	0.6 µl
Primer-reverse（10 µM）	0.6 µl
Template	10 pg ～ 100 ng
d.d.H2O	up to 50 µl

λ-DNAを鋳型とした0.5-10 kbpフラグメントの増幅の場合

PCR条件^*1
94°C	3分
94°C	20秒	25サイクル
65°C	20秒
72°C	10秒/kbp （1 kbp未満は5秒）
72°C	7分

5 µl 電気泳動

^*1　PrimerのデザインやTemplate等により反応の至適条件が変わることがあります。

実験例1　コロニーPCRによるインサート（3.0 kbp）の確認

M：OneSTEP Marker 2
(λ/Hind III, EcoR I double digest)
1% Agarose S

インサート長3.0 kbpのプラスミドを保持する大腸菌コロニーを爪楊枝でかきとり、 Gene RED PCR Mix PlusとＡ社製品の反応液に懸濁しPCR（増幅鎖長：3.1 kbp）を行った。

PCR条件

PCR条件①			PCR条件②＜A社推奨条件＞
反応所要時間 50分間			反応所要時間 110分間
94°C	3分		94°C	3分
94°C	20秒	25サイクル	94°C	20秒	25サイクル
60°C	20秒		60°C	20秒
72°C	30秒（10秒/kbp）		72°C	3分間

結果

PCR 条件②ではGene RED PCR Mix PlusとＡ社製品の標的配列の増幅が認められたが、PCR 条件①ではGene RED PCR Mix Plusのみで増幅が認められた。コロニーPCR において、Gene RED PCR Mix PlusはＡ社製品より増幅効率が高いため、反応時間を短縮することが可能であった。

実験例2　マウステール抽出DNA のPCR 増幅

マウステール2 mm （約20 mg）から下記3種類の各抽出方法で得られたゲノムDNA を鋳型として、Gene RED PCR Mix Plusを用いてPCR（増幅鎖長：400 bp）を行った。

抽出方法

＜抽出A： SDS + Proteinase K + PCI 精製＞
マウス尾2 mm程度にSDS溶解液99 µlとProteinase K (20 mg/ml)を1 µl加え、Vortexでよく攪拌する。55°Cの湯浴で1時間反応する。反応後、Vortexで攪拌する。(1)
13,000 x gで3分間遠心し、得られた上清をPCI（Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol）処理し、アルコール沈殿により精製する。12.5 ng/µlに希釈してサンプルとして使用。

＜抽出B： SDS + Proteinase K＞
抽出Aの（1）まで同様の操作を行った後、Proteinase Kを失活させるため95°Cで10分加熱する。13,000 x gで3分間遠心し、得られた上清を10倍希釈してサンプルとして使用。

＜抽出C：アルカリ抽出＞
マウス尾2 mm程度にアルカリ溶解液180 µlを加え、Vortexでよく攪拌する。95°Cで10分間反応する。反応終了後、1 M Tris-HCl (pH8.0)を20 µl加えてVortexでよく攪拌する。13,000 x gで3分間遠心し、得られた上清を10倍希釈してサンプルとして使用。

M：OneSTEP Marker 11
（pUC19/Msp I digest）
3% Agarose 21

反応液組成
Gene RED PCR Mix Plus	10 µl
Primer-forward（10 µM）	0.6 µl
Primer-reverse（10 µM）	0.6 µl
粗抽出DNA溶液	2 µl
d.d.H2O	up to 20 µl

PCR条件
94°C	3分
94°C	20秒	30サイクル
62°C	20秒
72°C	5秒/kbp （1 kbp未満は5秒）
72°C	5分

結果

いずれの抽出方法でも、Gene RED PCR Mix Plusによる標的配列の増幅が認められた。

実験例3　 0.5 ～ 10 kbp 断片の増幅

λDNAを鋳型に0.5 kbp、1.5 kbp、3 kbp、6 kbp、10 kbp 断片をPCR増幅し、反応終了液をそのままアガロースゲルにアプライし電気泳動した。

M： Gene Ladder Wide1（0.1-20 kb）
① - ⑤： 0.5 kbp、1.5 kbp、3 kbp、6 kbp、10 kbp
1% Agarose S

反応液組成
Gene RED PCR Mix Plus	25 µl
Primer-forward（10 µM）	1.5 µl
Primer-reverse（10 µM）	1.5 µl
λDNA（10 pg-10 ng）	2 µl
d.d.H2O	up to 50 µl

PCR条件
94°C	3分
94°C	20秒	25サイクル
65°C	20秒
72°C	10秒/kbp （0.5 kbは5秒、1.5 kbは15秒）
72°C	7分

結果

0.5 ～ 10 kbp までの断片を短時間に増幅することができた。

実験例4　コロニーPCRによるM13系ベクターのインサート確認

ここでは、M13 系ベクター（pUC19 DNA など）のインサートチェックにGene RED PCR Mix Plusと2 × M13 Primer Mix (組成：0.8 pmol/μl M13 forward primer, 0.8 pmol/μl M13 reverse primer, 0.1 mM Tris-HCl(pH7.5) を使用したコロニーPCR の使用例を紹介します。

プライマー配列
M13 forward primer	GTTTTCCCAGTCACGACGTT
M13 reverse primer	GGAAACAGCTATGACCATGA

反応液組成

必要本数分のGene RED PCR Mix を1.5 ml 容チューブに添加し、等量の2 × M13 Primer Mix を加え軽くピペッティングかタッピングで混合し、50 μl ずつPCR チューブに分注。

Gene RED PCR Mix Plus（2×）	25 µl
2 x M13 Primer Mix	25 µl
Total	50 µl

爪楊枝またはチップでコロニーを軽く突き、反応液中で懸濁（コロニーは多量に持ち込まない）。
直ちにPCRを行う。

PCR条件
94°C	3分
94°C	20秒	25サイクル
55°C	20秒
72°C	10秒/kbp （1 kbp以下の場合は10秒）

PCR 後、各反応液の5 ～ 10 μl をそのままアガロースゲルにアプライし、電気泳動。

主なM13系ベクター（no insert）のPCR増幅産物サイズ

M13系ベクター	増幅産物サイズ（no insert）
pUC18/19	121 bp
pBluescriptII	247 bp
pGEM-T easy	250 bp
pT7Blue	172 bp
pT7Blue2	388 bp
λZAPII	244 bp

M13プライマーのpUC18におけるアニーリング部位

	M13 forward primer
	5' AAGTTGGGTA ACGCCAGGGT TTTCCCAGTC ACGACGTTGT AAAACGACGG CCAGTGCCAA 3' TTCAACCCAT TGCGGTCCCA AAAGGGTCAG TGCTGCAACA TTTTGCTGCG GGTCACGGTT

	5' GCTTGCATGC CTGCAGGTCG ACTCTAGAGG ATCCCCGGGT ACCGAGCTCG AATTCGTAAT 3' CGAACGTACG GACGTCCAGC TGAGATCTCC TAGGGGCCCA TGGCTCGAGC TTAAGCATTA

	5' CATGGTCATA GCTGTTTCCT GTGTGAAATT GTTATCCGCT CACAATTCCA CACAACATAC 3' GTACCAGTAT CGACAAAGGA CACACTTTAA CAATAGGCGA GTGTTAAGGT GTGTTGTATG
	M13 reverse primer
	赤文字： Multi cloning sites 下線：プライマーのアニーリング部位

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実験例1 コロニーPCRによるインサート（3.0 kbp）の確認

PCR条件

結果

実験例2 マウステール抽出DNA のPCR 増幅

抽出方法

結果

実験例3 0.5 ～ 10 kbp 断片の増幅

結果

実験例4 コロニーPCRによるM13系ベクターのインサート確認

反応液組成

主なM13系ベクター（no insert）のPCR増幅産物サイズ

M13プライマーのpUC18におけるアニーリング部位

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実験例2　マウステール抽出DNA のPCR 増幅

実験例3　 0.5 ～ 10 kbp 断片の増幅

実験例4　コロニーPCRによるM13系ベクターのインサート確認