T7 Endonuclease I reaction Mix
T7 エンドヌクレアーゼ I リアクションミックス| 品名 | Code No. | 包装単位 | 価格 | 備考 |
|---|---|---|---|---|
| T7 Endonuclease I reaction Mix | 313-08801 | 50 µl | 15,000円 |
製造元 （株）ニッポンジーン
表示価格は希望納入価格 (税別) です。
製品説明
本品は、T7 phage 由来のNuclease とその反応バッファーが一液タイプになったプレミックス試薬です。本品に含まれるT7 Endonuclease I は、二本鎖DNA のミスマッチを認識し、切断する活性を有しており、ゲノム編集技術を用いた変異導入の確認に利用できます。
特長
・PCRとアガロースゲル電気泳動でミスマッチを簡単に検出！ ・シーケンス解析前の事前確認に！
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製品内容
| 構成品 | 容量 | 保存 | 備考 |
|---|---|---|---|
| T7 Endonuclease I reaction Mix | 50 µl x 1本 | -20°C |
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使用例
使用例 ミスマッチ塩基対や欠失 ・挿入を持つ基質DNA 断片の準備と酵素反応
| PCR 産物 | 100-250 ng | |
|---|---|---|
| 10 x アニーリングBuffer *1 | 1 μl | |
| ddWater | up to 9 μl |
*1 組成：100mM Tris-HCl (pH8.0), 1M NaCl
| 95°C | 5分 | |
|---|---|---|
| 95°C→85°C | 2°C/秒 | |
| 85°C→25°C | 0.1°C/秒 |
| 基質DNA断片 | 9 μl (100-250 ng) | |
|---|---|---|
| T7 Endonuclease I reaction Mix | 1 μl | |
| Total | 10 μl |
37°C、15 分間 *2
アガロースゲル電気泳動 *3
*2 電気泳動の結果、切断が見られない場合、37℃の反応時間を30 分～60 分に伸ばしてみる。
*3 非特異的切断が見られる場合、スピンカラムなどを用いてDNA 断片を精製した後、上記条件で変性、アニーリングを行う。
実験データ1. 各種Indel切断の確認
図. 1～18塩基の異なるIndelを持つDNA断片の切断
2種類のDNA断片を混合して変性、再アニールを行うことで、理論上50％のDNAが Indel (insertion / deletion) を持つDNA断片を調製した。
1～18塩基の異なるIndelを持つDNA断片9 μl（250 ng）に本品1 μlを加え、37℃ 15分間反応させた後、アガロースゲル電気泳動（2％ Agarose S）を行った。
結果
本品を用いてIndel 1～18塩基まで認識、切断できることを確認した。
実験データ2. iPS細胞を用いた切断活性試験 (データ提供：株式会社 特殊免疫研究所)
切断活性の高いgRNAを選定するため、エレクトロポレーション法にてgRNAとCas9からなるRNPをiPS細胞に導入し、バルク細胞集団よりゲノムを回収、変異導入解析を行った。
図. iPS細胞を標的とした切断活性確認試験
結果
A社切断酵素では切断できなかった変異導入細胞のゲノムについて、T7 Endonuclease I reaction Mix で切断確認することができた。
実験データ3. 各種塩基置換によるミスマッチの切断の確認
2種類のDNA断片を混合して変性、再アニールを行うことで、理論上50％のDNAが塩基置換によるミスマッチを持つDNA断片を調製した（図1）。 各種ミスマッチを持つDNA断片9 µl（180 ng）に本品を1 µlを加え、37℃ 15分間または60分間反応させた後、アガロースゲル電気泳動（2％ Agarose S）を行った（図2）。
図1. 3塩基ミスマッチを持つDNA断片の調製例
図2. 各種塩基置換によるミスマッチの切断の確認
結果
本品を用いて37℃,60分間で反応させることで、2塩基および3塩基のミスマッチを認識、切断できることを確認した。
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Q & A
- 凍結融解を繰り返しても良いですか？
- 50回の凍結融解でも本品はIndelを認識および切断できることを確認しております。
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資料 Data Sheet
製品マニュアル
SDS(Safety Data Sheet)
リーフレット
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関連情報
備考
- 本品は試験研究用試薬です。医薬品の用途には使用しないでください。
参考文献
- P Dickie, G McFadden, AR Morgan (1987) The site-specific cleavage of synthetic Holliday junction analogs and related branched DNA structures by bacteriophage T7 endonuclease I., Journal of Biological Chemistry, 262, 30, 14826-14836.
- L Vouillot, A Thélie, N Pollet (2015) Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases, Genes, Genomes, Genetics, 5, 407-415.
- 佐久間哲史，山本 卓（2014）TALENやCRISPR/Cas9の活性評価法と変異の検出法, 今すぐ始めるゲノム編集（山本編），pp.29-35，羊土社
関連製品
- Rapid Indel Detection Kit（変異検出キット）
- Cas9 Nuclease protein NLS
- Anti-Cas9 Monoclonal Antibody
- CUGA in vitro Transcription Kit（RNA大量合成キット）
問い合わせ先
- 購入に関するお問い合わせ先
- 富士フイルム和光純薬株式会社および同社代理店・特約店
- 富士フイルム和光純薬株式会社 製品検索サイト
- 製品に関するお問い合わせ先
- 株式会社ニッポンジーン 学術営業課
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