Csa, 96-7 DNA Polymerase

鎖置換型酵素

実験例1　RCA法による耐熱性と至適反応温度の評価 ＜Csa DNA Polymerase, 96-7 DNA Polymerase＞


data1

RCA法 反応条件
M13mp18 single strand DNA
20 ng
Universal primer
50 nM
dNTPs Mixture
0.25 mM each
Tris-HCl (pH 8.8 at 25°C)
20 mM
KCl
10 mM
(NH4)2SO4
10 mM
MgSO4
2 mM
Tween 20
0.1%
DNA Polymerase
8 units
全量
20 µl

反応
各温度にて 30分間

 

結果

data1

レーン
M： Gene Ladder Wide 1 (Code No. 313-06961)
D： 鋳型 DNA (M13mp8 single strand)

プライマー配列 （Universal Primer）
5'-GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTA-3'

電気泳動条件
0.7% Agarose S / TAE ゲル電気泳動
エチジウムブロマイド染色
SDSが含まれていないLoading Bufferを 使用

備考
本実験は3種の酵素を比較するために同じ反応液組成で反応させました。RCA法に各酵素に添付の専用バッファーを使用する場合は、「鋳型DNA、プライマー、dNTPs Mixture、専用10x Buffer、DNA Polymerase」を添加する反応系でまずはご検討ください。

 

実験例2　LAMP法*1 への利用 ＜Csa DNA Polymerase, 96-7 DNA Polymerase＞


3% Agarose 21
TAE ゲル電気泳動
エチジウムブロマイド染色

M： Gene Ladder Wide 1
(Code No. 313-06961)
1： Geobacillus 属菌由来鎖置換型
DNA Polymerase
2： Csa DNA Polymerase
3： 96-7 DNA Polymerase

LAMP法 反応条件*2
 
Csa DNA Polymerase
96-7 DNA Polymerase
Candidatus Liberibacter asiaticus DNA
1 x 106 copies
1 x 106 copies
FIP*
40 pmol
40 pmol
BIP*
40 pmol
40 pmol
F3 Primer*
5 pmol
5 pmol
B3 Primer*
5 pmol
5 pmol
Loop Primer F*
20 pmol
20 pmol
Loop Primer B*
20 pmol
20 pmol
dNTPs Mixture
1.4 mM each
2.0 mM each
10 × Reaction Buffer
1 ×
1 ×
DNA Polymerase
8 units
8 units
Total
25 µl
25 µl

反応
Csa DNA Polymerase
96-7 DNA Polymerase
65°C、60分間
60°C、60分間

* プライマー配列
  FIP: 5'-GCATGCCGAGGATCAATGCCTTGCTTAAAGAGCGTGCTACG-3'
BIP: 5'-TATGCCTAATGGCACGGGGGTAAGCTTCATCCGCCTTCGA-3'
F3 Primer: 5'-TGGGTTAAGTGATGCTGTGG-3'
B3 Primer: 5'-CAACAATATCAGCCCCTGCT-3'
Loop Primer F: 5'-TCTCAACTGTTTCATCAAACCTAGC-3'
Loop Primer B: 5'- CGTGGCGGTTTTTGCTACA-3'
*1 LAMP（Loop-mediated Isothermal Amplification）法は栄研化学株式会社が特許を保有しています。
*2 Candidatus Liberibacter asiaticus を検出するための LAMP プライマーセットは、先端技術を活用した農林水産研究高度化事業「難防除病害カンキツグリーニング病の拡大阻止技術の開発」において、国立研究開発法人 農業・食品産業技術総合研究機構 九州沖縄農業研究センターによって開発されました。

 

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