ISOIL

土壌からのDNA抽出キット

ISOILの改変プロトコールとネコブセンチュウの検出

「ISOIL」のプロトコールを改変することでDNAの抽出効率が良くなった例をご紹介致します。
さらに、抽出したDNAを鋳型にPCRでネコブセンチュウの検出を行った実験例もご紹介致します。

「ISOIL」は界面活性剤と熱処理の作用によりDNAを抽出しますが、「ISOIL for Beads Beating」はさらにビーズ破砕を行いますので、DNAの収量という点で両者を比較すると「ISOIL」の方が低くなる傾向があります。
この度、九州沖縄農業研究センター線虫制御研究室の岩堀様は、「ISOIL」のプロトコールを改変することによりDNAの抽出効率を飛躍的に改善し、さらにそのDNAを鋳型に病害線虫であるネコブセンチュウをPCRで検出することに成功されました。
その改変プロトコールは「ISOIL」のDNA収量を上げる有効な手段であり、さらに「ISOIL」を利用した土壌DNA研究の応用にも期待がもてます。

「ISOIL」改変プロトコール

プロトコール（赤字：改良のために追加した操作）

土壌サンプル（0.5 g）をマイクロチューブに入れる
↓凍結融解処理（－20゜Cまたは－80゜C, 1時間）、凍結後は室温で融解する
↓←20 mg, スキムミルク（final conc. 4%）
↓←950 μl, Lysis Solution HE
↓←50 μl, Lysis Solution 20S
↓十分に混合する
↓超音波処理（28KHz, 200W, 3～10分間）
↓インキュベート（65゜C, 60分間）、10分間隔で転倒混和する
↓凍結融解処理（－20゜Cまたは－80゜C, 1時間）、凍結後は室温で融解する
↓遠心（12,000 x g, 1分間, 室温）
上清600 μl を新しいチューブに移し、以降の操作はマニュアルに記載のプロトコール通りに行う

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実験データ

データ提供 : 独立行政法人九州沖縄農業研究センター　地域基盤研究部線虫制御研究室　室長岩堀英晶様

Data 1　標準プロトコールと改変プロトコールの比較

「ISOIL」を標準プロトコールと改変プロトコールでそれぞれ使用し、抽出できたDNAの量で抽出効率を比較した。その結果、改変プロトコールによりDNAの抽出効率は飛躍的に上がった。土壌サンプルは、九州沖縄農業研究センター内サツマイモ圃場（熊本県菊池郡西合志町）の土壌（黒ボク土）を使用した。

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Data 2　特異的プライマーによるネコブセンチュウの検出

改変プロトコールにて抽出されたDNAを鋳型にして、九州沖縄地域で主要な３種ネコブセンチュウ（サツマイモ、アレナリア、ジャワ）のミトコンドリア遺伝子を増幅させるプライマーでPCRを行ったところ、他生物のDNAに影響されることなくネコブセンチュウのDNAのみが増幅された。
上記３種いずれかのネコブセンチュウDNAが存在すれば、1.7kbのPCR産物が確認でき（下図左）、制限酵素Hinf I 処理によってこれらに特徴的なバンドパターンが確認され、種の特定が可能となる（下図右）。

PCRを行う上での注意点

PCRの条件についてはHarris et al.(1990) Journal of Nematology 22, 518-524の方法に準ずる。
抽出されたDNAを50 µlの滅菌蒸留水に溶解し、その0.2 µl を鋳型として用いる。
使用するTaq DNAポリメラーゼは、高感度増幅能を持つものを使用する。

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Data 3　ネコブセンチュウの検出感度の検討

これらの抽出・検出系におけるネコブセンチュウの検出感度について検討した。土壌サンプルは、九州沖縄農業研究センター内サツマイモ圃場の土壌を1/5,000ワグネルポットに詰め、１作サツマイモを栽培後の土壌を使用した。
その結果、ベルマン法による抽出で約100頭/20g土壌レベルの汚染土壌で、ネコブセンチュウの検出が可能であることが分かった（下図）。