ISOGEN、ISOGEN-LS

RNA抽出用試薬

ISOGENを用いたグラム陽性菌からのRNA抽出

グラム陽性菌は概して細胞壁が厚く、通常のプロトコルではRNAの収量がグラム陰性菌に比べて少なくなります。
そこで、グラム陽性菌の細胞壁をガラスビーズで破壊後、ISOGENを用いてRNAを抽出しました。

プロトコール

グラム陽性菌(3ml培養)
  ↓　遠心分離(10k×g、4ºC、10分間)(1.5ml×2tube)
沈殿*1
  ↓　←ISOGEN 300µl
  ↓　←ガラスビーズ 0.1g
  ↓　Vortex(2〜3分間、室温)*2
  ↓　←ISOGEN 700µl*3
  ↓　インキュベート(55ºC、30分間)
  ↓　遠心分離(10k×g、4ºC、10分間)*4
上清
  ↓　←クロロホルム 200µl
  ↓　強く混合(15秒間)
  ↓　静置(3分間、室温)
  ↓　遠心分離(12k×g、4ºC、15分間)
水相(500〜600µl)*5
  ↓　←イソプロパノール 500µl
  ↓　静置(5〜10分間、室温)
  ↓　遠心分離(12k×g、4ºC、15分間)
沈殿
  ↓　←70% EtOH 1ml
  ↓　遠心分離(7.5k×g、4ºC、5分間)
沈殿
  ↓　←乾燥後100µlのTEに溶解
Total RNA溶液

 

*1 可能な限り培地を除去
*2 RNAの回収率が低い場合には、Vortexでの細胞壁の破壊を徹底することで改善できる。
*3 この時点で、Sample : ISOGEN = 1 : 20になった。
*4 遠心分離によって細胞壁、不溶性の細胞破片、ガラスビーズ、溶菌していない細胞を除去し、上清のホモジネート液のみを新しいチューブに移す。不溶物が混入した場合、再度遠心分離を行う。また、 液量が少なくなった場合は不足分をISOGENで補って混合する。
*5 水相はISOGEN量の60%程度になる。

 

結果

通常のISOGEN法では少量のRNAしか抽出できなかったが、ガラスビーズを用いた上記実験方法を行った結果、純度、収量ともに大幅に改善された。

菌名 抽出法 OD260/280 RNA収量(µg) 写真
Nocardia otitidis caviarum 通常のISOGEN処理のみ 0.827 0.71 Lane ①
Nocardia otitidis caviarum ガラスビーズ+ISOGEN処理 1.618 4.70 Lane ②
Staphylococcus aureus PS96 通常のISOGEN処理のみ 0.866 0.74 Lane ③
Staphylococcus aureus PS96 ガラスビーズ+ISOGEN処理 1.798 4.30 Lane ④

 

 


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