RNAi：概説

　RNA interferenceにあまり関わっていない、あるいはこの新しく強力な技術について聞いたこともない読者のために、この文章を掲載しました。RNA interferenceとは何か、どのように作用するのか、何をすべきか、何を避けるべきかを、ステップごとに理解できるよう、この概説の数章を充てています。RNA interferenceは、小さなRNA分子で遺伝子を抑制できる大変魅力的な手法です。

導入

　過去15年間、mRNAの段階で遺伝子の発現を消失させてしまう手法の確立は、分子生物学者にとって夢でもあり悪夢でもあった。機能を喪失した細胞や生物を作るために、多くの分子が試されてきた。例えば、アンチセンス配列、リボザイム、キメラオリゴがそれにあたる。しかし、標的遺伝子の性質に依存する部分が多く、そのような分子の設計は試行錯誤を繰り返す他なかった。更に、その効果は予想しがたく、しばしば、不十分な抑制にしかならなかった(Braasch and Corey, 2002)。

10年以上前、植物学者達が思わぬ幸運に巡り会った。1990年、NapoliとStuitjeの2つのチームが、植物における過剰発現したchalcone synthase(CHS)の共抑制を報告した。より紫色の濃いツクバネアサガオを作ろうとしたところ、彼らは時々、予想外に全く逆の結果(白いアサガオ)を得ることがあった。この不思議な現象の機構は謎のままだったが、転写後遺伝子サイレンシング(PTGS)にCHS遺伝子の二本鎖RNA領域の分解産物が関与しているのではないかとする説が出された(Van der Krol et al., 1990 - Jorgensen et al., 1996)(表1)。

　菌類のNeurospora crassaでは、過剰発現した導入遺伝子も、導入遺伝子の発現を抑える転写後遺伝子サイレンシングを引き起こし得ることが示された。(Romano and Maciano, 1992)(表1)。

　1998年、これらの研究に基づき、カーネギー研究所のAndy Fireとマサチューセッツ大学のCraig Melloが、Caenorhabditis elegansを用いて、dsRNA(double-strand RNA)が、特異的かつ選択的に、効率良く遺伝子の発現を阻害し得ることを初めて示した。彼らの実験では、第一鎖(所謂センスRNA)は標的mRNAの対応する領域と同じ配列を有し、第二鎖(アンチセンスRNA)はそのmRNAと相補的な配列を有していた。その両者から生じたdsRNAは一本鎖RNA(アンチセンスRNA)の場合に比べて数桁の差が出るほど効果的に発現を阻害した。Fire等はこの現象をRNA interference、RNAiと呼んだ。これまでに、ほとんどの系統で、この遺伝子サイレンシング機構が動作することが示されている(表2)。

表1：転写後遺伝子サイレンシング機構
門 種 機構 エフェクター 文献
Fungi Neurospora quelling Transgenes Cogoni and Maciano, 1997.
Plants Arabidopsis PTGS Transgenes Elmayan et al., 1998.
Petunia Dehio and Schell, 1994.
Nicotiana Transcriptional gene silencing Transgenes, virus Furner et al., 1998.
Invertebrates C. elegans RNAi dsRNA Ketting et al., 1999.
Transcriptional gene silencing Transgenes Kelly and Fire, 1998.
Drosophila RNAi dsRNA Misquitta and Paterson, 1999.
shRNA Paddison et al., 2002.
co-suppression Transgenes Pal-Bhadra et al., 1999.
Paramecium Homology-dependent silencing Transgenes Ruiz et al., 1998.
Trypanosoma RNAi dsRNA Wang et al., 2000.
Vertebrates Danio rerio RNAi dsRNA Wargelius et al., 1999
Mus musculus RNAi dsRNA Wianny and Zernicka-Goetz, 2000.

表2：様々な種でのRNAiの例
種 文献
Caenorhabditis elegans Nematode Fire et al., 1998; Tavernarakis et al., 2000
Danio rerio Zebrafish Wargelius et al., 1999
Trypanosoma brucei Unicellular Wang et al., 2000
Hydra magnipapillata Cnidarian Lohmann et al., 1999
Schmidtea meditteranea Planarian Alvarado and Newmark, 1999
Escherischia coli Bacteria Tchurikov et al., 2000
Neurospora crassa Fungus Cogoni and Macino, 1999
Drosophila melanogaster Fruit-fly Bernstein et al., 2001
Mus musculus Mammals Wianny and Zernicka-Goetz, 1999
Arabidopsis thaliana Plants Akashi et al., 2001

RNAiの機構

　Hannonと共同研究者のEmily Bernsteinが発見しDICERと名付けた酵素がdsRNAと接触し、dsRNAをsmall interfering RNAまたはsi RNAと呼ばれる小さな断片に分解するところから、RNAiが始まる。DICERはRNase III核酸分解酵素ファミリーの一種である。タンパク質複合体が分解されたRNAを集め、標的となるmRNA等、適合する配列を持ち細胞内でRNAを捜し出して分解する際の指標とする(この部分の概説はBosher and Labouesse, 2000を参照)。

　図1は最新の情報を盛り込んだRNAi現象のモデルである(Akashi et al., 2001; Willecke et al., 2002)。このモデルでは導入遺伝子、転移因子、ウィルス、dsRNAもしくは異常な一本鎖RNAが細胞内に出現する事により、RNAiが始まる。dsRNAの合成には、RNA依存RNA合成酵素(RdRP)が関与している。

図1：RNAiの仮説モデル

図中のステップを要約すると下記の通り。

  • Step 1：dsRNAの認識と検査
  • Step 2：RNase III活性によるdsRNAの開裂とsiRNAの生成
  • Step 3：siRNAとRISC複合体結合因子の結合
  • Step 4：相補的な標的mRNAの認識
  • Step 5：siRNAと相補的な領域の中央(図中では黄色の三角形で表示)で標的mRNAを開裂
  • Step 6：標的mRNAの分解とRISC複合体(図2)の再利用。
図1：RNAiの仮説モデル(Click here to enlarge(fig1_l.jpg))

 

図2：RISC複合体の仮説モデル
図2：RISC複合体の仮説モデル

 

哺乳動物へのRNAiの応用

　幾つかの無脊椎動物ではRNAiが大変活発である。故に、この技術を哺乳動物にも使えるようにする事に関心が集まった。しかし、哺乳動物の細胞はウィルス感染を防ぐ様々な防御機構を発達させており、RNAiを用いたアプローチは容易ではない。実際に、極めて低い濃度のウィルスdsRNAが存在するだけでインターフェロンの応答(急性応答)を惹起し、dsRNA応答プロテインキナーゼ(PKP)を活性化する。2',5'アデニル酸合成を活性化する転写因子EIF2aをPKPが燐酸化して不活性化し、最終的にはRNase Lが活性化される。このカスケードは翻訳の全体的な非特異的抑制を引き起こし、アポトーシスを誘発してしまう(この部分の概説はWilliams, 1997; Gil and Esteban, 2000を参照)。

図3：非特異的及び特異的dsRNAサイレンシング経路
図3：非特異的及び特異的dsRNAサイレンシング経路

　2000年にマウス胚に対し、dsRNAを用いた最初の試みがなされた。WiannyとZernicka-Goetzは、マウス卵母細胞及び初期胚で、注入したdsRNAが3つの遺伝子(E-cadherin、c-mos、延長因子1aの影響化にあるMmGFP)を特異的に阻害する事を示したが、翻訳の阻害それによって引き起こされるPKRの応答は、胚が発達を続けも観察されなかった。

　しかし、確実な手順ができ上がるまで、更に一年の時間が必要だった。Ribopharma AG(Kulmbach, Germany)が開発した方法(Ribopharma AGが特許を取得)によって哺乳動物の細胞におけるRNAiの機能が初めて示された。DICERによって生成されるdsRNAと同じような小さなdsRNAならば、細胞の死を引き起こさない、とRibopharmaの研究者は論じた。その主張は正しく、Ribopharma方式ではSIRPLEXTMと呼んでいる短いdsRNA(20〜24 bp)を用いて、急性応答を起こす事なくヒト細胞で特定遺伝子の阻害に成功した。そのため、SIRPLEXTMは、ヒトを含む多くの種における、標的遺伝子の確認と臨床応用に適している。後に別のグループが行った同様の実験(Elbashir et al., 2001; Caplen et al., 2001)によって、これらの結果が確認された。このデータから、多くの研究室で、小さなdsRNAであるsiRNA(small interfering RNA)が、望ましいRNAiエフェクターとされるようになった。

small RNA研究の最近の進展

　siRNAに代わるものを開発すべく、Paddison et al.(2002)は、ヘアピン構造に折り畳んだ小さなRNAで特定遺伝子の機能を阻害できるか試みた。この実験は、Caenorhabditis elegansの幾つかの遺伝子が、ヘアピン構造のRNAをコードしており、それによるRNAiで他の遺伝子を制御している、という報告に刺激を受けたものである。ヒトとマウスの様々な正常及び癌細胞株を用いて試したところ、short hairpin RNA(shRNA)は、siRNAと同程度に遺伝子の発現を抑制し得る事が分かった。更に、shRNAはin vivoでの再結合の反応速度が、同等の二量体よりも有利である事も示された。それ以上に重要な事は、著者らが細胞の分化後も長く効果を示すshRNAを合成させるためのトランスジェニック細胞株を作成した事である。

　近年、別の小RNA(21〜25ヌクレオチド)も遺伝子の発現を制御できる事が示された。small temporally regulated RNA(stRNA)として知られているこれらのRNAが、Caenorhabditis elegansの成長の間の遺伝子の発現の時期を制御することが報告されていた。stRNAとsiRNAの構造は良く似ているが、両者は異なる機構を通じて遺伝子を制御している点には注意すべきである(この点の概説についてはBanerjee and Slack, 2002を参照)。siRNAとは対照的に、22ヌクレオチドのstRNAは標的mRNAの翻訳開始以降に制御を行い、mRNA自体には全く影響を及ぼさない。最新の研究により、最初に線虫で報告された2つのstRNAは、後生動物に存在する数百種のmicro-RNA(miRNA)から成る巨大なファミリーに属している事が明らかになった(Grosshans and Slack, 2002)。

RNAi技術の応用

　当初、研究者は、Caenorhabditis elegans、ショウジョウバエ、トリパノソーマ等、種々の無脊椎動物を用いた系で、RNAiを使用していた。更に、近年、幾つかのグループが、異なる種類の哺乳動物細胞株(特にHeLa細胞)で、この方法を用いてタンパク質の生合成を抑制できる事を報告し、RNAiはin vitroでの遺伝子サイレンシングに広範に用い得る手法である事を示した。これらの結果から、RNAiは、遺伝子の機能の実証(同定と属性の特定)のための手段として広く認知されるようになった。プロテオミクスの重要性が高まるにつれて、RNAiは更に重視されるようになるだろう。更に、短いdsRNAを用いるRNAiならば、部分的にしか配列が決定されていない遺伝子の機能を調べる事ができる。

よって、下記のような研究では、RNAiは必須の技術となるだろう。

siRNAユーザーガイド

siRNAの設計

　siRNAが発現を抑制する効率は、二量体の長さ、対にならず突出している3'末端の長さ、突出部分の配列によって決まる事を、1999年にTuschl等が報告した。

この研究結果から、標的mRNAの領域、すなわちsiRNA二量体の配列を選ぶ際に、下記の指針基づいて行うよう推奨されている。

　配列の選択作業は簡潔であり、しかも多くの研究でその効果が証明されている。

ニッポンジーンでは、アンチセンス研究分野での主導的研究者によって有効性が証明されているsiRNAの配列を文献から選択した。対応する標的遺伝子の一覧を表3に示す。記載の遺伝子は実験の陽性対照になり得る。  
 
遺伝子名 種
β-actin Human
NuMA Human
cdk1 Human
Eg-5 Human
Lamin A/C Human
Lamin B1 Human
Vimentin Human
GFP Jellyfish
Luciferase GL2 Firefly
Luciferase GL3 Firefly
表3：ニッポンジーンが販売しているコントロールsiRNA

コントロールsiRNAの選択に用いた参考文献

  1. Harborth, J., Elbashir, SM., Bechert, K., Tuschl, T. and Weber, K.(2001). J. Cell. Sci. 114, 4557-65.
  2. Caplen, NJ., Parrish, S., Imani, F., Fire, A. and Morgan, RA.(2001). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 9742-47.
  3. Elbashir, SM., Harborth, J., Lendeckel, W., Yalcin, A., Weber, K. and Tuschl, T.(2001). Nature(London). 411, 494-8.

RNAi研究の陰性対照

　多くの研究者が、(RNAiに限らず)実験の善し悪しは対照の選び方次第であると言うが、RNAi研究では、特に対照実験が重要である。

　故に、結果から可能な限り多くの情報を引き出すために、RNAi実験を行う場合、下記の注意事項を念頭におくと良い。

siRNA二量体の調製

　siRNAのアニーリング方法は、文献や書物によって多少異なっている。ここではニッポンジーンが推奨するアニーリング方法を紹介する。

  1. 適当量の溶解済み一本鎖siRNAを別のチューブに取り、DEPC treated water(RNase-free)で50µMに希釈する。
  2. 別のチューブで以下の混合液を調製する。
    50µM siRNA sence 30µl
    50µM siRNA antisense 30µl
    5×annealing buffer 15µl
    Total 75µl
  3. 溶液を水浴中で90〜95°C、5分処理した後、軽く遠心し、溶液をチューブの底に集める。
  4. 37°Cで1時間静置し、使用するまで4°Cに置いておく。

　以上で10mM二本鎖siRNA溶液の調製を行うことができる。
　この際、溶液中のバッファーの最終濃度は以下のようになる。

　また、このプロトコルは混合溶液の比を守ることで、そのままスケールアップが可能である。

　ある文献では、以下のようなアニーリングバッファーで行っている場合もある。

　二本鎖となったRNAは比較的ヌクレアーゼに対して安定となるが、すぐに使用しない、あるいは、使用後残ったsiRNAを保存するといった場合には、-20°C以下で凍らせておく。
　アニーリングしたsiRNAの凍結融解は5回までにする。

　別のアニーリング方法としては、PCR用のサーマルサイクラーを使う方法もある。
　チューブにオリゴヌクレオチド、5×annealing buffer、DEPC treated water（RNase-free）を入れる。その際、ミネラルオイルは重層しない。

サーマルサイクラーのサイクル条件

  1. 95°C、2 min.
  2. 25°Cまで45分間で下げる
  3. その後、そのまま放置する場合は4°Cに設定

　終了後、軽く遠心して4°Cに置いておく。保存する場合には-20°C以下で凍らせておく。

選択したsiRNAが機能しない場合どうするか

　非常に効率の高い手法ではあるが、選択したsiRNAが目的の細胞系で機能しない事もあり得る。そのような場合、下記の点を検討すると良い。

参考文献

Akashi H, Miyagishi M, Taira K. Suppression of gene expression by RNA interference in cultured plant cells. Antisense Nucleic Acid Drug Dev, 2001, 11(6):359-67.

Alvarado A.S., and Newmark P.A. Double-stranded RNA specifically disrupts gene expression during planarian regeneration, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, 96, 5049-54.

Banerjee D, Slack F. Control of developmental timing by small temporal RNAs: a paradigm for RNA-mediated regulation of gene expression. Bioessays, 2002, 24(2):119-29.

Bernstein E, Denli AM, Hannon GJ. The rest is silence. RNA, 2001, 7(11):1509-21.

Bosher JM, Labouesse M. RNA interference: genetic wand and genetic watchdog. Nat Cell Biol, 2000, 2(2):E31-6.

Braasch DA, Corey DR. Novel antisense and peptide nucleic acid strategies for controlling gene expression. Biochemistry, 2002, 41(14):4503-10

Caplen, N.J., Parrish, S., Imani, F., Fire, A. & Morgan, R.A. Specific inhibition of gene expression by small doublestranded RNAs in invertebrate and vertebrate systems. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001, 98: 9742-9747.

Cogoni C, Macino G. Homology-dependent gene silencing in plants and fungi: a number of variations on the same theme. Curr Opin Microbiol, 1999, 2(6):657-62.

Dehio C, Schell J. Identification of plant genetic loci involved in a posttranscriptional mechanism for meiotically reversible transgene silencing. Proc Natl Acad Sci U S A, 1994, 91(12):5538-42.

Elbashir SM, Lendeckel W, Tuschl T. RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs. Genes Dev, 2001, 15(2):188-200.

Elmayan T, Balzergue S, Beon F, Bourdon V, Daubremet J, Guenet Y, Mourrain P, Palauqui JC, Vernhettes S, Vialle T, Wostrikoff K, Vaucheret H. Arabidopsis mutants impaired in cosuppression. Plant Cell, 1998, 10(10):1747-58.

Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC. Potent and specific genetic interference by doublestranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature, 1998, 391(6669):806-11.

Furner IJ, Sheikh MA, Collett CE. Gene silencing and homology-dependent gene silencing in Arabidopsis: genetic modifiers and DNA methylation. Genetics, 1998, 149(2):651-62.

Gil J, Esteban M. Induction of apoptosis by the dsRNA-dependent protein kinase (PKR): mechanism of action. Apoptosis, 2000, 5(2):107-14.

Grosshans H, Slack FJ. Micro-RNAs: small is plentiful. J Cell Biol, 2002, 156(1):17-21.

Jorgensen RA, Cluster PD, English J, Que Q, Napoli CA. Chalcone synthase cosuppression phenotypes in petunia flowers: comparison of sense vs. antisense constructs and single-copy vs. complex T-DNA sequences. Plant Mol Biol, 1996, 31(5):957-73.

Kelly WG, Fire A. Chromatin silencing and the maintenance of a functional germline in Caenorhabditis elegans. Development, 1998, 125(13):2451-6.

Ketting RF, Haverkamp TH, van Luenen HG, Plasterk RH. Mut-7 of C. elegans, required for transposon silencing and RNA interference, is a homolog of Werner syndrome helicase and RNaseD. Cell, 1999, 99(2):133-41.

Lohmann JU, Endl I, Bosch TC. Silencing of developmental genes in Hydra. Dev Biol, 1999, 214(1):211-4.

Misquitta L, Paterson BM. Targeted disruption of gene function in Drosophila by RNA interference: a role for nautilus in embryonic somatic muscle formation. Proc Natl Acad Sci U S A, 1999, 96(4):1451-6.

Newmark PA, Alvarado AS. Not your father's planarian: a classic model enters the era of functional genomics. Nat Rev Genet, 2002, 3(3):210-9.

Paddison PJ, Caudy AA, Bernstein E, Hannon GJ, Conklin DS. Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells. Genes Dev, 2002, 16(8):948-58.

Pal Bhadra M, Bhadra U, Birchler JA. Role of multiple trans-acting regulators in modifying the effect of the retrotransposon copia on host gene expression in Drosophila. Mol Gen Genet, 1998, 259(2):198-206.

Romano N, Macino G. Quelling: transient inactivation of gene expression in Neurospora crassa by transformation with homologous sequences. Mol Microbiol, 1992, 6(22):3343-53.

Ruiz F, Vayssie L, Klotz C, Sperling L, Madeddu L. Homology-dependent gene silencing in Paramecium. Mol Biol Cell, 1998, 9(4):931-43.

Tavernarakis N, Wang SL, Dorovkov M, Ryazanov A, Driscoll M. Heritable and inducible genetic interference by doublestranded RNA encoded by transgenes. Nat Genet, 2000, 24(2):180-3.

Tchurikov NA, Chistyakova LG, Zavilgelsky GB, Manukhov IV, Chernov BK, Golova YB. Gene-specific silencing by expression of parallel complementary RNA in Escherichia coli. J Biol Chem, 2000, 275(34):26523-9.

Tuschl T, Zamore PD, Lehmann R, Bartel DP, Sharp PA. Targeted mRNA degradation by double-stranded RNA in vitro. Genes Dev, 1999, 13(24):3191-7.

van der Krol AR, Mur LA, Beld M, Mol JN, Stuitje AR. Flavonoid genes in petunia: addition of a limited number of gene copies may lead to a suppression of gene expression. Plant Cell, 1990, 2(4):291-9.

Wang Z, Morris JC, Drew ME, Englund PT. Inhibition of Trypanosoma brucei gene expression by RNA interference using an integratable vector with opposing T7 promoters. J Biol Chem, 2000, 275(51):40174-9.

Wargelius A, Ellingsen S, Fjose A. Double-stranded RNA induces specific developmental defects in zebrafish embryos. Biochem Biophys Res Commun, 1999, 263(1):156-61.

Wianny F, Zernicka-Goetz M. Specific interference with gene function by double-stranded RNA in early mouse development. Nat Cell Biol, 2000, 2(2):70-5.

Willecke et al. 2002 http://www.genetik.uni-bonn.de/seminare/zusam/C_Ha/C_Ha.pdf

Williams BR. Role of the double-stranded RNA-activated protein kinase (PKR) in cell regulation. Biochem Soc Trans, 1997, 25(2):509-13.

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