Plasmid Mini Prep Kit

アルカリ-SDS法によるプラスミドDNA調製キット

Code No.
製品名
包装単位
希望納入価格
311-01521Plasmid Mini Prep Kit
60回分
9,000円

 形質転換により得られたトランスフォーマントが保持するプラスミドを解析することは、クローニング実験を進める上で重要なステップである。数多くのトランスフォーマントを解析するには、簡便で純度の高いプラスミドの調製方法が必要である。Plasmid Mini Prep Kitを用いてプラスミドDNAを調製することによりsmall-scaleでの制限酵素、ゲル電気泳動、サザンブロッティング、塩基配列決定などによる解析に十分な純度と量が得られる。

  1. Solution I : 6 ml
  2. Solution II : 12 ml
  3. Solution III : 9 ml
  4. TE(RNase)[10µg/ml RNase (DNase free) in TE (pH8.0)] : 3 ml

細菌コロニー
↓LB-broth 2ml, 37°C, 一晩振とう培養注1)
↓1.5ml用微量遠心チューブに移す
↓遠心分離(10K×g, 4°C, 2分間)注2)
沈澱
↓←Solution I, 100 µl
↓ボルテックスをかけて沈澱を完全に懸濁注3)
↓←Solution II, 200 µl注4)
↓氷中で5分間放置(5分間以上反応させない)注5)
↓←Solution III, 150 µl注6)
↓氷中で5分間以上放置注7)
↓遠心分離(10K×g, 4°C, 5分間)注8)
上清
↓上清と等量のフェノール/クロロホルム(1:1)を加えてよく混ぜる
↓遠心分離(10K×g, 4°C, 5分間
上清
↓上清の2.5倍量のエタノールを加える
↓-20°Cに20分間〜数時間放置する注9)
↓遠心分離(10K×g, 4°C, 5〜10分間)
沈澱
↓70%エタノール洗浄注10)
↓真空乾燥
沈澱
↓沈澱を30〜50µlのTE(RNase)に溶解する注11)
Plasmid DNA溶液

本品を使用し、上記の基本プロトコールに従えば、得られるプラスミド試料は、ほとんどがcc型でありoc型はわずかである。ニッポンジーンで行った実験では、この状態で4°Cに保存しておいてもoc型の増加はわずかであった。
 本品は基本的にはBirnboim、Dolyの方法(アルカリ-SDS法)に従っている。従ってE. coliの染色体DNAの混入は他の方法に比べて少ない。時々アガロースゲル電気泳動でcc型のバンドよりわずかに移動度の大きいかすかなバンドが観察される。このバンドはプラスミドの構造が変性したものであると考えられ、ある制限酵素で非常に切断されにくいようである。しかし、このバンドは量的には少なく以後の実験に大きな支障とならないことが多い。

Maniatis, T. et al. : "Molecular Cloning", A Laboratory Manual, 2nd ed. (1989)

制限酵素によるプラスミドの切断条件

塩化セシウム密度勾配遠心を行い、高純度に精製したプラスミドとPlasmid Mini Prep Kitにより精製したプラスミドを用いて、いくつかの制限酵素について1 µgのプラスミドを完全分解するのに必要な酵素量を調べた。

使用プラスミド

pBR322
制限酵素
完全分解必要酵素量(unit)
CsCl調製プラスミド
MiniPrep調製プラスミド
BamH I
1
2
EcoR I
2
2
Hind III
1
5
Nde I
1
5
Pst I
1
1
Sal I
6
12
Sph I
1
2
pUC19
制限酵素
完全分解必要酵素量(unit)
CsCl調製プラスミド
MiniPrep調製プラスミド
BamH I
2
3
EcoR I
3
5
Hinc II
5
7
Hind III
2
2
Pst I
1
1
Sac I
3
5
Sma I
2
6
Sph I
2
4
Xba I
1
>200
Plasmid Prepperとの比較
 
Plasmid Prepper(Code No. 316-02671)
Plasmid Mini Prep Kit(Code No. 311-01521)
方法
リゾチーム-煮沸法
アルカリ-SDS法
調製時間
30分間
2時間
収量
pBR系
1〜3 µg/1.5 ml culture
2〜5 µg/1.5ml culture
pUC系
6〜10 µg/1.5 ml culture
10〜30 µg/1.5ml culture

*宿主として大腸菌HB101を用いた場合、プラスミドの回収率が低いことがある。そのような際には、Plasmid Mini Prep Kit(Code No. 311-01521)を使用した方がよい。

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