ISOTISSUE

動物組織からのDNA抽出キット

　ISOTISSUE(アイソティッシュ)は、動物組織からゲノムDNAを抽出するためのキットである。操作中フェノール、クロロホルムのような有害物質を使用せず、また、微量遠心チューブを用いるため、操作が簡便である。全行程を約3時間で終了することができる。本品により得られたゲノムＤＮＡは数十〜数百 kbpで、しかも高純度なので、制限酵素の基質やPCRに用いることができる。

1. Extraction Buffer : 20 ml
2. 20 mg/ml Proteinase K : 1.5 ml
3. 5 mol/l NaCl : 7 ml
4. TE (pH8.0) : 20 ml
5. 10 mg/ml RNase A : 0.2 ml
6. 3 mol/l Sodium Acetate (pH 5.2) : 1 ml×2
7. 3 mol/l LiCl : 7 ml
8. 150 mmol/l Sodium Citrate : 7 ml

試料(組織) 50 ml (1.5 mlマイクロチューブ) ↓Extraction Buffer 500 µl ↓ホモジナイズ注1) ↓←20 mg/ml Proteinase K 40 µl ↓ボルテックス注2) ↓インキュベート, 55°C, 15分間 ↓←5 mol/l NaCl 200µl ↓インキュベート, 55°C, 5分間 ↓静置, 氷上, 5分間 ↓遠心分離(12K×g, 4°C, 10分間) 上清 ↓←イソプロパノール(上清 : イソプロパノール ＝ 1 : 1) ↓撹拌注3) ↓遠心分離(2K×g, 4°C, 5秒間) 沈殿 ↓←TE(pH 8.0) 400 µl ↓懸濁注4) ↓←10 mg/ml RNase A 5 µl ↓インキュベート, 55°C, 15分間 ↓←20 mg/ml Proteinase K 5 µl ↓撹拌 ↓インキュベート, 55°C, 15分間 ↓←3 mol/l Sodium Acetate (pH 5.2) 40 µl ↓撹拌注3) ↓←イソプロパノール 440 µl ↓撹拌注3) ↓遠心分離(2K×g, 4°C, 5秒間) 沈殿 ↓←wash solution注5) 1ml 沈殿 ↓←wash solution注5) 1ml 沈殿 ↓70%エタノール洗浄 沈殿 ↓エタノール洗浄注6) 沈殿 ↓乾燥 ↓←TE (pH 8.0)注7) 200〜500 µl DNA溶液		注1)	滅菌処理したはさみなどで可能な限り細かく切り刻む。テフロンホモジナイザーなどでホモジナイズしても良い。
		注2)	完全に均一にはなりにくいが、可能な限り均一に近い状態にする。
		注3)	染色体DNAを損なわないように穏やかにかつ十分に混合する。
		注4)	組織の色が着色した濁った懸濁液状になる。
		注5)	wash solutionはキットに含まれている3 mol/l LiClおよび150 mmol/l Sodium Citrateを用いて調製する。 ・ wash solution : 0.3 mol/l LiCl ・ 15 mmol/l Sodium Citrate ・ 75% エタノール
		注6)	乾燥を容易にするために行う。省略しても良い。
		注7)	注7) 4°C前後で一晩静置することによってほぼ完全に溶解する。

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　第三版(2002.11.05)

マウス各組織から得られたゲノムDNAのパルスフィールドゲル電気泳動パターン Lane 1 : T4 dC DNA Lane 2 : 肝臓ゲノムDNA Lane 3 : 腎臓ゲノムDNA Lane 4 : 心臓ゲノムDNA

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