| Code No. | 製品名 | 包装単位 | 希望納入価格 |
|---|---|---|---|
| 316-06211 | ISOIL | 50 回用 |
28,000円 |
| 319-06201 | ISOIL for Beads Beating | 50 回用 |
35,000円 |
| 313-06221 | Lysis Solution BB SP1 | 50 ml |
3,200円 |
土壌の遺伝子工学的な分析には、土壌微生物環境を正確に反映した土壌DNA抽出が不可欠です。しかしながら、これまでの土壌DNA抽出キット(海外メーカー品)では、黒ボク土(日本国土の16%、耕地の50%)など火山灰土壌からのDNA抽出が困難であり、日本の土壌微生物研究の進展の妨げとなっていました。本キットは、国内開発技術を用いた、日本の土壌に適応した土壌DNA抽出キットです。
＊ISOIL for Beads Beatingの場合
＊＊ISOILの場合
製品名 ISOIL ISOIL for Beads Beating Lysis Solution BB SP1 DNA 用途
遺伝子資源
土壌DNAの定量説明 ISOILではDNAの抽出方法として界面活性剤存在下での加熱抽出を採用しています(*1)。そのため、物理的な力を加えることなく土壌中のDNAを抽出するため、高分子のDNAを抽出することができます。従って、ISOILで抽出した土壌DNAは、メタゲノムライブラリーの作成等、遺伝子資源としての利用に適しています。
*1 : 強固な細胞壁を持つ微生物等は破砕されない可能性がありますので、あらかじめご了承ください。界面活性剤による化学的な溶菌作用と、Beads Beatingの物理的な菌体破砕(*2)を合わせることで、強固な細胞壁を持つ微生物からもDNAを抽出することができ(*3)、実際の土壌微生物群集構造を反映した土壌DNAを抽出することができます。従って、抽出した土壌DNAは、PCR-DGGE解析等を用いた土壌微生物の群集構造解析や土壌診断、土壌DNAの定量による土壌バイオマスの推定等に適しています。
*2 : ISOIL for Beads Beatingをお使いいただくためには、別途Beads Beater(ビーズ式破砕機)が必要になります。
*3 : ISOIL for Beads Beatingで抽出したDNAはBeads Beatingによる物理的せん断を受けている可能性があるので、あらかじめご了承ください。ISOIL for Beads Beating専用のオプション製品です。黒ボク土の中でも特にアロフェン質が多い試料からDNAを抽出する場合には、ISOIL for Beads Beatingに添付のLysis Solution BBの代りにLysis Solution BB SP1を使用することで収量を向上させることができます。 ISOIL、ISOIL for Beads Beatingにおける土壌DNA抽出法は東京大学TLOが特許を出願中です。
ニッポンジーンは、土壌DNA抽出法に関して東京大学TLOよりライセンスを受けています。
ISOIL Lysis Solution HE Lysis Solution 20S Purification Solution Precipitation Solution Wash Solution Ethachinmate TE(pH 8.0) ポリロート マニュアル
ISOIL for Beads Beating Beads Tubes Lysis Solution BB Lysis Solution 20S Purification Solution Precipitation Solution Wash Solution Ethachinmate TE(pH 8.0) ポリロート マニュアル
Lysis Solution BB SP1 Lysis Solution BB SP1 50 ml×1
ISOIL ISOIL for Beads Beating 土壌サンプル(0.2〜0.5 g)を2 mlチューブに入れる
↓←950 µl, Lysis Solution HE
↓←50 µl, Lysis Solution 20S
↓十分に混合する
↓インキュベート(65°C, 1時間)
↓土壌サンプル(0.2〜0.5 g)をBeads tubeに入れる
↓←950 µl, Lysis Solution BB
↓←50 µl, Lysis Solution 20S
↓Beads Beat(4〜6 m/秒間または4,200〜6,800 rpm, 30〜45秒間)
↓黒ボク土の中でも特にアロフェン質が多い試料からDNAを抽出する場合には、ISOIL for Beads Beatingに添付のLysis Solution BBの代りにLysis Solution BB SP1を使用することで収量を向上させることができます。 ISOIL, ISOIL for Beads Beating共通 ↓遠心(12,000×g, 1分間, 室温)
↓上清600 µlを新しいチューブに移す
↓←400 µl, Purification Solution
↓十分に混合する
↓←600 µl, クロロホルム
↓ボルテックス, 15秒間
↓遠心(12,000×g, 15分間, 室温)
↓水層800 µlを新しいチューブに移す
↓←800 µl, Precipitation Solution
↓十分に混合する
↓遠心(20,000×g, 15分間, 4°C)
↓上清を捨てる
↓←1 ml, Wash Solution
↓数回転倒混和
↓遠心(20,000×g, 10分間, 4°C)
↓上清を捨てる
↓←1 ml, 70%エタノール
↓←2 µl Ethachinmate
↓ボルテックス
↓遠心(20,000×g, 5分間, 4°C)
↓上清を捨てる
↓風乾
↓←100 µl, TE (pH 8.0)
DNA溶液
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ISOIL(第1版, 2004.08.17)
ISOIL、ISOIL for Beads BeatingおよびF社取扱い製品を用いて抽出した土壌DNAについて、アガロースゲル電気泳動を行った。土壌試料はそれぞれ0.5 gを使用し、抽出は各製品の標準プロトコルに従って行った。
- A : 東大弥生圃場対照区土壌(アロフェン質黒ボク土, 火山灰土壌)
- B : 埼玉農試畑土壌(灰色低地土, 非火山灰土壌)
- C : 兵庫農試森林土壌(褐色森林土, 非火山灰土壌)
- M : OneSTEP Marker 1 (λ/Hind III)
ISOIL : 10 µ l (1/10量、土壌0.05 g分)を電気泳動
ISOIL for Beads Beating : 5 µl (1/20量、土壌0.025 g分)を電気泳動
F社取扱い製品 : 5 µl (1/20量、土壌0.025 g分)を電気泳動
Agarose S, 1% gel
参考 : ISOILおよびISOIL for Beads Beatingで抽出したDNAのサイズ比較
- A : ISOIL
- B : ISOIL for Beads Beating
- 1 : Marker 1(λ/Hind III)
- 7 : Marker 7GT(T4 GT7+T4 GT7/Bgl I)
A、Bは東大弥生圃場対照区土壌(アロフェン質黒ボク土)から抽出した土壌DNA。
Agarose H, 0.5% gel
結果
ISOILおよびISOIL for Beads Beatingでは3種の土壌から十分な量のDNAを抽出することができた。一方、F社取扱い製品では火山灰土壌であるアロフェン質黒ボク土からはDNAがほとんど得られなかった。また、ISOILで得られるDNAの長さは50 kbp以上であり、ISOIL for Beads Beatingでは〜23 kbpであった。
ISOILおよびISOIL for Beads Beatingを用いて抽出した土壌DNAのPCR-DGGE(変性剤濃度勾配ゲル電気泳動)解析を行った。
- A : 東大弥生圃場対照区土壌(アロフェン質黒ボク土, 火山灰土壌)
- B : 東大田無農場牧草地(アロフェン質黒ボク土, 火山灰土壌)
- C : 千葉農試森林土壌(アロフェン質黒ボク土, 火山灰土壌)
- D : 草地試験場永年採草地土壌(灰色低地土, 火山灰土壌一部混入)
- E : 埼玉農試畑土壌(灰色低地土, 非火山灰土壌)
- F : 兵庫農試森林土壌(褐色森林土, 非火山灰土壌)
データ提供 : 東京大学 農学生命科学研究科 応用生命化学専攻 頼泰樹 博士 結果
それぞれの土壌試料で特徴的なバンドパターンが得られた。また、抽出DNAは、特に精製することなくPCR-DGGE解析に用いることができた。
ISOIL for Beads BeatingおよびF社取扱い製品で抽出したDNAの純度を比較した。抽出したDNAの濃度をあらかじめ測定した後、A260の値が約0.2となるようにサンプルを調製し、200〜800 nmの連続波長を測定した。また、DNAの純度を比較する対照としてLambda DNA(318-00414)を使用した。
東大弥生圃場対照区土壌 埼玉農試畑土壌 兵庫農試森林土壌 アロフェン質黒ボク土, 火山灰土壌 灰色低地土, 非火山灰土壌 褐色森林土, 非火山灰土壌 結果
F社取扱い製品で抽出した土壌DNAは不純物が多く、正確なA260の測定が困難だった。一方、ISOIL for Beads Beatingで抽出した土壌DNAの吸収スペクトルはA260にピークのある理想的なDNAの吸収スペクトルに近かったことから、抽出した土壌DNAは従来品(F社取扱い製品)より高純度であることが分かった。
ISOILおよびISOIL for Beads Beatingで抽出した土壌DNAを鋳型として、PCRによる系統群の検出を行った。抽出した土壌DNAはPCRの鋳型としてそのまま使用でき、また、従来の製品ではDNAの抽出が難しく解析が困難であったアロフェン質黒ボク土試料からもはっきりとしたPCRバンドが得られた。
東大弥生圃場対照区土壌(アロフェン質黒ボク土) 埼玉農試畑土壌(灰色低地土) 兵庫農試森林土壌(褐色森林土)
- A : Bacteria (723 bp)
- B : Bacillus species and relatives (600 bp)
- C : High-G+C gram-positive bacteria (542 bp)
- D : Streptomyces species and related taxa (1,243 bp)
- E : Fungi, protists, and green algae (555 bp)
- F : Plants (597 bp)
- M : OneSTEP Ladder 100 (0.1〜2 kbp)
Agarose S, 2% gel
系統群検出用プライマー参考文献
Small-Scale DNA Sample Preparation Method for Field PCR Detection of Microbial Cells and Spores in Soil.
Kuske CR, Banton KL, Adorada DL, Stark PC, Hill KK, Jackson PJ.
Appl Environ Microbiol. 1998 Jul 1;64(7):2463-72.
ISOILおよびISOIL for Beads Beatingで抽出したDNAをEcoR Iで消化し、アガロースゲル電気泳動した。ISOILおよびISOIL for Beads Beatingで抽出したDNAは、制限酵素処理の基質として十分な品質であることが分かった。
- A : 東大弥生圃場対照区土壌(アロフェン質黒ボク土, 火山灰土壌)
- A* : AのEcoR I消化産物
- B : 埼玉農試畑土壌(灰色低地土, 非火山灰土壌)
- B* : BのEcoR I消化産物
- C : 兵庫農試森林土壌(褐色森林土, 非火山灰土壌)
- C* : CのEcoR I消化産物
- M : OneSTEP Marker 1 (λ/Hind III)
Agarose S, 1% gel
