ISOFECAL

ISOFECAL for Beads Beating

ISOFECALおよびISOFECAL for Beads Beatingは糞便サンプルからDNAを抽出するためのキットです。高純度のDNAを高い効率で抽出することができます。

～ISOFECALとISOFECAL for Beads Beatingの違いについて～

・ISOFECAL

　本キットではDNAの抽出方法として界面活性剤存在下での加熱抽出を採用しています。したがって、強固な細胞壁を持つ微生物からのDNA抽出は難しいと考えられます。
　検出対象が大腸菌の場合など、グラム陰性細菌の検出等にご使用ください。
　実際の糞便微生物相を反映した糞便DNAを抽出したい場合には、ISOFECAL for Beads Beatingをお薦めします。

・ISOFECAL for Beads Beating

　本キットではDNAの抽出方法として界面活性剤による化学的な溶菌作用と、Beads Beatingによる物理的な菌体破砕法の併用を採用しています。これによって、強固な細胞壁を持つ微生物からもDNAを抽出することができ、実際の糞便微生物相を反映した糞便DNAを得ることができます。
　ただし、ISOFECAL for Beads Beatingで抽出したDNAはBeads Beatingによって物理的せん断を受けている可能性がありますので、あらかじめご了承ください。
　また、本キットをご使用になるにはビーズ式破砕機が必要です。

[ISOFECAL]	[ISOFECAL for Beads Beating]
Lysis Solution F* 50 ml×1本 Purification Solution* 20 ml×1本 Precipitation Solution 40 ml×1本 Wash Solution 50 ml×1本 TE (pH 8.0) 5 ml×1本 Ethachinmate 100 µl×1本 マニュアル 1部	Beads Tube 50本 Lysis Solution F* 50 ml×1本 Purification Solution* 20 ml×1本 Precipitation Solution 40 ml×1本 Wash Solution 50 ml×1本 TE (pH 8.0) 5 ml×1本 Ethachinmate 100 µl×1本 マニュアル 1部

*注意:Lysis Solution FおよびPurification Solution中に白い結晶が析出する場合がありますが、品質、性能に問題はありません。このような場合には、容器ごと37〜65°C程度でインキュベートし、結晶を完全に溶解させてからご使用ください。

　ISOFECALおよびISOFECAL for Beads Beatingに含まれる試薬はすべて室温保存が可能です。
　ただし、Precipitation Solution、Wash Solution、Ethachinmateについては、使用時のコンタミネーション(カビや雑菌等の混入)に十分注意し、開封後は低温(2〜10°C)で保存することをお奨めします。

• 本品は試験研究用試薬ですので、医薬品、その他の目的にはご使用になれません。
• 試薬についての基本的な知識のある方以外は取り扱わないでください。
• 本品のお取り扱いは、マニュアル記載内容通りに行ってください。
• マニュアル記載内容と異なったお取り扱いによるトラブルにつきましては、弊社では責任を負いかねます。
• ISOFECALにおける糞便DNA抽出法は東京大学TLOが特許を出願しておりニッポンジーンは糞便DNA抽出法に関して東京大学TLOよりライセンスを受けています。

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キット以外に必要な試薬及び機器等

ビーズ式破砕装置(2 mlチューブ対応のもの, ISOFECALでは不要) 70%エタノール クロロホルム マイクロピペット ピペットチップ 2 mlマイクロチューブ インキュベーター マイクロ遠心機 ボルテックスミキサー

1.ISOFECAL

1. 0.2 gの糞便サンプルを2 mlチューブに入れる。
2. 1 mlのLysis Solution Fを添加する。
3. つまようじ等を用いて糞便を縣濁し、1分間ボルテックスした後、65°Cで1時間インキュベートする。
   • 糞便が完全に縣濁されていることを確認してください。また、インキュベート中、10〜20分おきにボルテックスまたは転倒混和することをお薦めします。
4. 遠心(12,000×g, 5分間, 室温)する。
5. 上清600 µlを新しいチューブに移し、400 µlのPurification Solutionを添加し、十分に混合する。
   • 糞便がLysis Solution Fを吸収してしまい、遠心上清が600 µl回収できない場合があります。このような場合は溶液の比率をそのままに、ステップ5〜7をスケールダウンしてご使用ください。
     • ステップ4 遠心上清 : Purification Solution : クロロホルム=6 : 4 : 6
     • ステップ6 水層 : Precipitation Solution=1 : 1
     • ステップ8以降、変更なし。
6. 600 µlのクロロホルムを添加し、15秒間ボルテックスした後、遠心(12,000×g, 15分間, 室温)する。
7. 中間層を入れないように注意しながら水層800 µlを新しいチューブに移し、800 µlのPrecipitation Solutionを添加して十分に混合し、遠心(20,000×g, 15分間, 4°C)する。
   • ご使用の遠心機の最大遠心力が20,000×gよりも小さい場合は、遠心機の最大遠心力(だたし12,000×g以上)で遠心してください。
8. 上清を捨て、Wash Solutionを1 ml加えて数回転倒混和し、遠心(20,000×g, 10分間, 4°C)する。
   • できるだけ上清を取り除いて下さい。上清に含まれる物質はPCRを阻害する可能性があります。また、DNAの収量が少ない場合、この段階では沈殿を目で見ることはできません。
9. 上清を捨て、1 mlの70%エタノールと2 µlのEthachinmateを加えてボルテックスした後、遠心(20,000×g, 5分間, 4°C)する
   • ご使用の遠心機の最大遠心力が20,000×gよりも小さい場合は、遠心機の最大遠心力(だたし12,000×g以上)で遠心してください。
   • 70%エタノールにEthachinmateを加えることで、糞便DNAを安定して回収することができます。ただし、Ethachinmateを添加しない場合は、ボルテックスを避け、転倒混和によって穏やかに沈殿を洗浄してください。
10. 上清を捨て、風乾した後、沈殿を100 µlのTE (pH 8.0)に溶解する。
    

2.ISOFECAL for Beads Beating

1. 0.2 gの糞便サンプルをBeads Tubeに入れる。
2. 1 mlのLysis Solution Fを添加する。
3. Beads Beat(4〜6 m/秒間または4,200〜6,800 rpmで30〜45秒間)する
   • Beads Tubeの蓋がしっかり閉まっていることを確認してください。蓋のゆるみはBeads Beating中の液漏れの原因となります。
4. 遠心(12,000×g, 5分間, 室温)する。
5. 上清600 µlを新しいチューブに移し、400 µlのPurification Solutionを添加し、十分に混合する。
   • 糞便がLysis Solution Fを吸収してしまい、遠心上清が600 µl回収できない場合があります。このような場合は溶液の比率をそのままに、ステップ5〜7をスケールダウンしてご使用ください。
     • ステップ4 遠心上清 : Purification Solution : クロロホルム=6 : 4 : 6
     • ステップ6 水層 : Precipitation Solution=1 : 1
     • ステップ8以降、変更なし。
6. 600 µlのクロロホルムを添加し、15秒間ボルテックスした後、遠心(12,000×g, 15分間, 室温)する。
7. 中間層を入れないように注意しながら水層800 µlを新しいチューブに移し、800 µlのPrecipitation Solutionを添加して十分に混合し、遠心(20,000×g, 15分間, 4°C)する。
   • ご使用の遠心機の最大遠心力が20,000×gよりも小さい場合は、遠心機の最大遠心力(だたし12,000×g以上)で遠心してください。
8. 上清を捨て、Wash Solutionを1 ml加えて数回転倒混和し、遠心(20,000×g, 10分間, 4°C)する。
   • できるだけ上清を取り除いて下さい。上清に含まれる物質はPCRを阻害する可能性があります。また、DNAの収量が少ない場合、この段階では沈殿を目で見ることはできません。
9. 上清を捨て、1 mlの70%エタノールと2 µlのEthachinmateを加えてボルテックスした後、遠心(20,000×g, 5分間, 4°C)する
   • ご使用の遠心機の最大遠心力が20,000×gよりも小さい場合は、遠心機の最大遠心力(だたし12,000×g以上)で遠心してください。
   • 70%エタノールにEthachinmateを加えることで、糞便DNAを安定して回収することができます。ただし、Ethachinmateを添加しない場合は、ボルテックスを避け、転倒混和によって穏やかに沈殿を洗浄してください。
10. 上清を捨て、風乾した後、沈殿を100 µlのTE (pH 8.0)に溶解する。
    

製品マニュアルをご覧になるにはAdobe ReaderやAdobe Acrobat Plug-in等、PDFを表示できるソフトウェアが必要です。

　ISOFECAL(第1版, 2004.11.19)

　ISOFECAL for Beads Beating(第1版, 2004.11.19)

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1.糞便試料から抽出したDNAのアガロースゲル電気泳動

　ISOFECAL、ISOFECAL for Beads Beating、Q社糞便DNA抽出キットを用いて、糞便試料各0.2 gからDNAを抽出し、それぞれ抽出したDNAの1/200を電気泳動した(実験はDuplicateで行った)。

		M : OneSTEP Marker 1, 2.5 µl(0.1 µg) 1 : ISOFECALで抽出したDNA(試料1) 2 : ISOFECALで抽出したDNA(試料2) 3 : ISOFECAL for Beads Beatingで抽出したDNA(試料1) 4 : ISOFECAL for Beads Beatingで抽出したDNA(試料2) 5 : Q社製キットで抽出したDNA(試料1) 6 : Q社製キットで抽出したDNA(試料2)   Agarose S 1% gel, EtBrで染色
A260の値から算出した実際の収量 製品名 試料1(µg/0.2 g sample) 試料2(µg/0.2 g sample) ISOFECAL 75 74 ISOFECAL for Beads Beating 133 115 Q社製キット 5.9 5.4
結果 ISOFECALおよびISOFECAL for Beads Beatingは、ともにQ社製糞便DNA抽出キットの10倍以上のDNAを得ることができた。

 

2.抽出したDNAを用いたPCR

　ISOFECAL、ISOFECAL for Beads Beating、Q社糞便DNA抽出キットを用いて抽出したDNAを鋳型として、PCRにより16Sリボソーム遺伝子を検出した

PCR reaction mixture

10×Gene Taq Universal Buffer	5 µl
2.5 mmol/l dNTP Mixture	4 µl
5 µmol/l 16S rDNA Primer mix	2 µl
Template DNA(0, 16, 80, 400, 2000, 10000 pg)	5 µl
Gene Taq NT(5 units/µl)	0.5 µl
H2O	33.5 µl
Total	50 µl

↓
PCR [94°C, 2 min. → (94°C, 1 min. → 50°C, 1 min. → 72°C, 1.5 min.) ×25 cycles]
↓
PCR終了後、1/5量(10 µl)を電気泳動

ISOFECAL	ISOFECAL for Beads Beating	Q社製キット
M : OneSTEP Ladder 100, 1.5 µl C : No Template Control 1 : Template DNA=16 pg 2 : Template DNA=80 pg 3 : Template DNA=400 pg 4 : Template DNA=2000 pg 5 : Template DNA=10000 pg Agarose S 2% gel, EtBr染色

結果
ISOFECALおよびISOFECAL for Beads Beatingで抽出したDNAを用いた場合、鋳型量16 pgまでバンドを検出できたが、Q社製糞便DNA抽出キットで抽出したDNAを用いた場合は鋳型量16 pgのバンドを検出することはできなかった。

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