Thermostable β-Agarase

【耐熱性】 アガロースゲルを分解する酵素

Code No.
製品名
包装単位
希望納入価格
317-07123

Thermostable β-Agarase

30 units
5,600円
311-07121
300 units
18,000円

特長 >プロトコル >使用例 >保存条件 >Q&A >マニュアル >リーフレット >MSDS >関連製品 >English

Thermostable β -Agaraseは、(独)海洋研究開発機構が深海底泥から発見した耐熱性微生物由来のアガラーゼであり、極めて耐熱性に優れている特長を持っています。
アガラーゼは、アガロースゲルをneoagaro-oligosaccharideに分解する酵素です。
例えば、低融点タイプのアガロースゲルで電気泳動したDNAのゲルブロックを再融解後、β-Agaraseで分解すると、その溶液は再びゲル化しなくなります。従って、大きなDNA断片でも比較的傷つけることなく、容易に回収することが可能です。また、従来のβ-Agaraseと比較して耐熱性に優れているため、簡便・短時間にアガロースゲルから DNA を抽出することが出来ます。

形状: 50mmol/l NaCl, 20mmol/l Tris-HCl(pH7.5)

単位の定義: 1unit は、60℃で1分間当たり1µmolのD-ガラクトースに相当する量の還元糖をアガロースゲルから生成する酵素活性とする。

本酵素は独立行政法人海洋研究開発機構 海洋・極限環境生物圏領域における研究により、有人潜水調査船「しんかい 6500 」を用いて深海から採取された耐熱性微生物に由来しています。
詳しくは、シーエムシー出版 『酵素開発・利用の最新技術』 第 5 章 深海微生物からの有用酵素の探索 p41-52(著者;秦田勇二、大田ゆかり、 日高祐子、能木裕一)をご参照下さい。
提供:(独)海洋研究開発機構

● 冷蔵保存が可能。

● アガロースゲル融解液に酵素を添加するだけの簡単操作。

● 至適温度が50~60℃なので、スタンダードタイプのアガロースにも使用可能。
  ※ アガロースゲルブロックから数 kbp 以上の DNA を抽出する場合は、スタンダードタイプのアガロースは適しておりませんので、低融点アガロースをご使用ください。

● 最短10 分で反応可能。

● スケールアップが可能。

● アルコール沈殿による精製の必要がなく、ゲル分解後のDNA 溶液をそのままクローニングや制限酵素反応などの基質として使用可能。

● 温和な反応条件のため、せん断の少ないDNA の回収が可能。

基本プロトコール:アガロースゲルブロック(200mg)からのDNA 抽出
切り出したアガロースゲルブロック200mg(~200µl)をチューブに入れる
5~10分間加熱し、アガロースゲルを完全に融解する(*1)
アガロースゲルが融解したことを確認し、50~65℃の恒温槽に移して(30~60秒ほど放置し)冷ます(*2)
6 units(6μl)のThermostable β-Agaraseを添加し、混和する
50~65℃で5~10分間保温し、アガロースを分解する(*3)
氷上に静置し、再凝固しないことを確認する(*4)(必要に応じてアルコール沈殿などの精製をする)
Fastプロトコール:低融点タイプアガロースゲルブロック(200mg)からのDNA 抽出
0.5~3%低融点タイプアガロース(ゲル融点65℃以下)/TAE/ゲルブロック200mg(~200μl)を1.5 ml 容チューブに入れる
Thermostable β-Agarase 6units(6µl)を加える。(TBE バッファー使用の場合は、酵素添加前に65℃~70℃、10分間保温してゲルを融解する)
65℃、10分間保温し、5分毎にタッピングして混和する
氷上に静置し、再凝固しないことを確認する

*1.アガロースやバッファーの種類によって融点は異なる。(p.2:ニッポンジーンのアガロース)
*2.Thermostable β-Agarase は50~60℃で最大活性を示す。
*3.アガロースゲルブロックの量や容器の大きさ、Thermostable β-Agaraseの添加量によって反応時間が異なる。
*4.未分解のアガロースゲルが残っているとDNAの回収率が低下することがある。未分解ゲルが残っている場合は、再度プロトコールのはじめから反応を行う。

データ提供 (独)海洋研究開発機構

使用例 1: アガロースゲルブロックから回収した DNA 断片の PCR

使用例 2: アガロースゲルブロックから回収したDNA断片(500bp)のクローニング

使用例 3: アガロースゲルブロックから回収したDNA断片(100bp以下)のクローニング

使用例 4: 分子量の大きいDNA断片の低融点タイプアガロースゲルからの回収

使用例 5: アガロースゲルブロックから回収したDNA断片の塩基配列解析

参考資料: 「酵素添加量の検討」

・冷蔵(2~8℃)

・ 輸送時:冷凍(製品到着時の酵素溶液は凍結しておりますが、品質に問題ありません)
・ 4℃、-20℃で2年間保存(室温で1年間保存)してもアガロース分解活性に低下は見られない。
・110回まで、凍結融解によるアガロース分解活性の低下は見られない。

Q1. 使用する酵素量は減らすことができますか?

A1. Thermostable β- Agarase の基本プロトコールで推奨する酵素量は、200 mg のゲルブロックに対して 6µl (6 units) ですが、ゲルの濃度や反応条件によっては 1 回に使用する酵素量を減らすことができます。(TAE または TBE でゲル作製時)

反応時間: 5分間処理(アガロースゲル:200 mg)
Agarose 濃度
酵素添加量
1 回分のコスト
1.0% Agarose S 2.0µl (2 units)
120 円
1.5% Agarose S 3.0µl (3 units)
180 円
2.0% Agarose S 5.0µl (5 units)
300 円
1.5% Agarose XP 3.0µl (3 units)
180 円
反応時間: 10分間処理(アガロースゲル:200 mg)
Agarose 濃度
酵素添加量
1 回分のコスト
1.5% Agarose S 1.5µl (1.5 units)
90 円
2.0% Agarose S 3.0µl (3 units)
180 円
3.0% Agarose 21 5.5µl (5.5 units)
330 円
*1 回分のコストは 300 units 包装の価格で計算しています。

Q2. DNA の回収率はどのくらいですか?

A2. 原理上、切り出したゲル中の DNA は全量回収されます。

Q3. 反応液の最終溶液量はどれくらいになりますか?

A3. 200 mg のアガロースゲルを用いた場合、最終溶液量は約 200µl になります。

Q4. 反応液を濃縮するにはどうすればよいですか?

A4. アルコール沈殿を行なって下さい。
例)得られた DNA 溶液(ゲル分解液)に対して 0.1 倍量の 3 mol/l Sodium acetate を添加する(必要に応じて共沈剤の Ethachinmate も添加し混合する)。0.8~1 倍量のイソプロパノール(または 2.5 倍量のエタノール)を添加して混合し、室温で 2~10 分間静置後、遠心分離(12 K×g, 10 分間)して上清を除去する。沈殿を残したチューブに 70% エタノールを 1 ml 程度加え、遠心分離(12 K×g, 5 分間)して上清を除去する。沈殿を室温で 15 分間放置して乾燥後、適当量の TE バッファーにて溶解する。

Q5. 分子量の大きい DNA 断片を回収することができますか?

A5. Thermostable β- Agarase は大きな DNA 断片も、物理的なせん断の少ない状態で回収できることを確認しております。(数十 bp~166 kbp の DNA フラグメントを回収して確認) ただし、取り扱う DNA のサイズが大きくなればなる程、アガロースゲル電気泳動での分離が困難になり、ピペッティング等の操作でもせん断されやすくなります。

Q6. 反応液は PCR 反応に使用できますか?

A6. PCR 反応液に対し、Thermostable β-Agarase を用いたアガロース分解溶液の添加量を 1/8 倍量以下にすることで使用できることを確認しております。
例)PCR 反応液の容量が 20µl であれば、アガロース分解溶液の添加量を 2.5µl 以下にする。

Q7. 反応液はクローニングに使用できますか?

Thermostable β-Agarase で回収した DNA 溶液を、そのままライゲーション反応と形質転換に使用できることを確認しております。(Ligation - Convenience Kit と ECOS™ Competent E.coli DH5αを使用して確認)

Q8. 反応液は転写反応に使用できますか?

A8. Thermostable β- Agarase で回収した DNA 溶液を、そのまま転写反応に使用できることを確認しております。
CUGA® 7 in vitro Transcription Kit を使用して確認)

Q9. 反応液はシークエンスに使用できますか?

A9. Thermostable β- Agarase で回収した DNA 溶液を、そのままシークエンスに使用できることを確認しております。(ABI 社 377 シーケンサーを使用して確認)ただし高濃度・高分子量のアガロース分解物が混入すると、解析機器の機種によっては故障の原因につながる可能性があります。高分子量のアガロースゲル分解物は遠心分離やフェノール・クロロホルム処理で除くことができます。

Q10. 変性アガロースゲルからの RNA 抽出に使用できますか?

A10. 使用できますが、変性アガロースゲルブロックに含まれるホルムアルデヒドが酵素活性を阻害するため、添加する酵素量を増やす必要があります。
例)100 mg の 1.5% アガロース S 変性ゲルブロックを 90℃、5 分間でゲルを融解した後、8µl(8 units)の酵素を添加し、60℃、10 分間の反応でアガロースを分解する。

 Thermostable β-Agarase マニュアル (第4版)

 Thermostable β-Agarase リーフレット (No.188)

Thermostable β-Agarase MSDS


Code No.
製品名
包装単位
希望納入価格
316-02551

β-Agarase I

100 units
20,000円
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