TA-Blunt Ligation Kit Q&A

Q1：5×Ligation Mixと10×Enhancer solution が-20°Cで凍結していないのですが問題ないですか？

A1：問題ありません。5×Ligation Mixと10×Enhancer solution は-20°Cでは凍結しません。

<注意>　 -80°Cでは凍結しますが、凍結させた状態で保存するとライゲーション効率が著しく悪くなる恐れがありますので避けて下さい。

Q2：5×Ligation Mixと10×Enhancer solutionは混和してから使用した方が良いですか？

A2：使用前に混ぜる必要はありません。冷凍庫から出してすぐにご使用できます。

<注意>　ピペッティング等で混和してもライゲーション効率に悪影響はでません。但し、激しいピペッティング、ボルテックスは避けてください。

Q3：反応時間は本当に30分間で良いのですか？

A3：はい。30分間で十分なライゲーション効率が得られます。

Q4：ライゲーションに使用するDNAは、どの溶液で調製すればよいですか？

A4：ddH2OやTE buffer(pH8.0) で調製して下さい 。

<注意>　高塩濃度のバッファーやEDTA等のキレート剤濃度が高いバッファーでDNA溶液を調整すると、ライゲーション効率が著しく低下する場合がありますので避けて下さい。

Q5：反応時間を16時間やオーバーナイトにして使用することはできますか？

A5：はい、できます。 しかし、16時間やオーバーナイトで反応を行っても大幅な改善は見られませんので、30分間の反応時間で十分です。

Q6：反応温度4°Cにおいて、16時間やオーバーナイトにて使用することはできますか？

A6：はい、できます。

Q7：反応スケールを下げることはできますか？

A7：はい、できます。ただし、その場合は使用するDNA量も少なくして反応系全体をスケールダウンして下さい。そうすることで高効率を保持したままでのスケールダウンが可能となり、以降の実験に都合の良いスケールでご使用いただくことができます。

<注意>　DNA量を減らさずに5×Ligation Mixと10×Enhancer solutionの使用量のみを減らした場合は、 ライゲーション反応が至適条件ではなくなり、反応効率が大きく低下する恐れがあります。また、本製品はベクターDNA量と10×Enhancer solutionの量比が非常に重要です。10µlスケール以下での使用は、ピペット操作による誤差も大きくなりライゲーション効率の良い条件を維持することが難しくなりますのでお奨めしません。

Q8：ライゲーションに使用するベクター量はどのくらいを目安にしたらよいですか？

A8：20µlの反応系には約0.025pmolのベクターDNAを使用して下さい。3kbpのベクターDNAの場合は約50ngとなります。

<注意> 本製品は、反応に用いるベクターDNA量と10×Enhancer solutionの量比が非常に重要になりますので、ベクター量が推奨モル数より少なすぎたり、多すぎる場合にはライゲーション効率が著しく低下する恐れがあります。ベクター量は厳密にお守り下さい。インサートDNA量はインサートサイズによって至適モル量が異なります。

>>>TA-Blunt Ligation Kit 参考資料「ベクター：インサートモル比の検討」

Q9：ライゲーション反応を室温(25°C)で行うことはできますか？

A9：はい、室温(25°C)でもライゲーション反応ができます。

Q10：サンプル数が多いのですが、あらかじめ5×Ligation Mixと10×Enhancer solutionを混ぜたプレミックスを作製してから使用することはできますか ？

A10：はい、できます。

<注意>　ただし、プレミックスは使用直前に調製し、調製後はすぐに使用して下さい。プレミックス調製後、長時間経過するとライゲーション効率が低下する恐れがあります。10分間程度の氷上静置では問題なくライゲーションできることを確認しております。

Q11：効率の良いライゲーションを行うにはどのようにしたらよいですか？

A11： ベクターDNAとインサートDNAのモル比を最適化することが重要です。また、その最適条件はDNAの末端形状、インサートの長さ、ベクターの大きさによっても異なります。 ニッポンジーンではpBluescriptII SK(+) (Stratagene社)、pGEM®-T(Promega社)をベクターDNAとして使用した場合について、様々な条件でデータ取りを行い、本キットにおけるDNAモル比の推奨条件を紹介しておりますので、ご参考下さい。

>>>TA-Blunt Ligation Kit 参考資料「ベクター：インサートモル比の検討」

Q12：平滑末端と粘着末端の両方を持ったインサートDNAとベクターDNAのライゲーション反応を行いたいのですが可能ですか？　あるいは、粘着末端ライゲーションで使用できますか ？

A12：粘着末端をもったインサートについては、本キットの効果を発揮することができません。粘着末端を持つインサートで高効率なライゲーションを行う場合は、Ligation-Convenience Kitをご使用下さい。

>>>Ligation-Convenience Kit

Q13：セルフライゲーションを行いたいのですが可能ですか？

A13：はい、できます。本キットのライゲーション反応条件に従って反応を行ってください。

Q14：反応終了液をそのまま大腸菌の形質転換に使用することができますか？

A14-1：ケミカルコンピテントセルでの形質転換の場合はそのまま使用できます。ただし、使用する反応液量はコンピテントセルの1/10量以内にして下さい。多量の反応液を使用した場合、形質転換効率が低下することがあります。

A14-2： エレクトロポレーション法で形質転換する場合は、反応終了液をフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール処理、クロロホルム/イソアミルアルコール処理後、エタノール沈澱法によりDNAを回収してからddH2OまたはTE buffer(pH8.0)に溶解してから形質転換を行って下さい。エタノール沈澱を行う際にエタチンメイトを使用すると、より効率良くDNAを回収することができます。

>>>Ethachinmete(エタチンメイト)

A15：大腸菌形質転換でECOS ™コンピテントセルを使用したいのですが、ライゲーション反応液は何%まで持ち込んでもよいですか ？

Q15：ECOS ™コンピテントセルを使用して形質転換を行う場合は、ライゲーション反応液はコンピテントセル体積の5%までにして下さい。 5%以上の反応溶液を形質転換に使用したい場合は、反応液をフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール処理、クロロホルム/イソアミルアルコール処理、エタノール沈澱法により DNAを回収して、そのDNAをコンピテントセル体積の5％量になるようにddH2OまたはTE buffer(pH8.0)に溶解してから形質転換に用いて下さい。

Q15：ライゲーション産物を濃縮したいのですが、そのままエタノール沈澱してもよいですか？

A15：ライゲーション産物をそのままエタノール沈殿すると、形質転換時にコロニー数が著し く減少します。エタノール沈澱を行いたい場合は、マニュアルに記載の方法に従って、ライゲーション産物をフェノール/クロロホルム精製してからエタノール沈殿して下さい。 また、エタチンメイトを使用してエタノール沈殿を行うと、効率良くDNAを回収することができます。

>>>Ethachinmete(エタチンメイト)

Q16：エタチンメイトで調製したベクターDNAやインサートDNAを使用してライゲーションを行っても問題ありませんか？

A16：はい、問題ありません。20µlの反応系にエタチンメイト3µl以内の持込みであればライゲーション効率に変化がないことを確認しております。ただし、3µl以上の持込みがある場合はライゲーション効率が低下する恐れがあります。

Q17：ライゲーション反応産物を一時保存する場合はどうしたらよいですか？

A17：-20°Cに保存して下さい。融解後はそのまま形質転換実験に用いることができます。熱処理は特に必要ありません。

Q18：ライゲーション反応後に熱処理によるLigaseの失活を行うことができますか？

A18：はい、できます。 70°C、10分間の熱処理でLigaseの失活を行うことができます。

Q19：市販のTAクローングキット中のライゲーション試薬をTA-Blunt Ligation Kitに置き換えて使用してもよいですか？

A19：はい、できます。ライゲーションにTA-Blunt Ligation Kitを使用することで、高効率なTAクローニングを行うことができます。ただし、ライゲーション条件はTA-Blunt Ligation Kitの条件を使用して下さい。ニッポンジーンでは、市販されている代表的なTAクローニングキットのライゲーションに本キットを使用することで、市販品のまま使用するよりも高効率なクローニングができることを確認しております。

Q20：様々なライゲーションキットが市販されていますが、他のライゲーションキットと比較してTA-Blunt Ligation Kitのライゲーション効率はよいのですか？

A20：はい、よいです。本品はTAクローニング(PCR産物のTベクターへのライゲーション)、平滑末端ライゲーション専用のライゲーションキットですので、TAクローニング、平滑末端ライゲーションにおいては他の市販されているライゲーションキットよりも高いライゲーション効率を得ることができます。

<注意>　粘着末端ライゲーション、または粘着末端を含んだDNAのライゲーションには使用しないで下さい。本品はTAクローニング(PCR産物のTベクターへのライゲーション)、平滑末端ライゲーション専用のライゲーションキットです。

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