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サポート

 弊社製品についての技術的なご相談・ご要望・ご質問・お見積のご依頼は、ご利用の代理店もしくは下記連絡先にて承ります。お気軽にご相談下さい。

〒930-0834 富山市問屋町二丁目7番18号
TEL:076-451-6548 FAX:076-451-6547
E-mail: URL:https://www.nippongene.com

質問 : オリゴについて

1. 合成スケールはどれを選んだらいいですか、また保証収量はいくらですか?
 実際の合成スケールと保証ODに関しては各合成サービスの製品仕様の表をご覧ください。 合成スケールは合成スタート時に使用する塩基のモル数です。したがって、そのすべての塩基の合成がうまくいった場合の収量は合成スケールで示した通りとなります。しかし、実際には合成機によって合成のカップリング効率が異なり、オリゴの鎖長が長ければ長いほど、合成途中でストップしたオリゴの混入する可能性が高くなりますので実際に得られるモル数とは異なっています。弊社ではさらに精製の回収率を考慮に入れて保証収量を設定しております。
50 mer以上のオリゴのカートリッジ精製・HPLC精製については0.2μmoleスケールとなります。これは長鎖オリゴの合成効率、あるいは精製の回収率を考えると0.05μmoleでは十分な収量を得られない可能性があるからです。
2. ニッポンジーンでの合成スケジュール・納期はどのようになっていますか?
 オリゴヌクレオチドをニッポンジーンのホームページからご注文の場合、午後5時までの受注が当日受注分となります。FAXでのご注文の場合、納期は+1日となりますので、ご了承ください。納期の異なるオリゴを同時にご注文された場合は、納期の遅いほうに合わせてまとめて送りいたします。ご注文のなかに収量不足等で再合成になったものがある場合、再合成ができ次第まとめてお送りいたします。その場合は、E-mail又はFAXでご連絡いたします。
営業、出荷は原則として月曜から金曜まで行っております。祝祭日、年末年始、夏期休業の場合は納期が変更になります。ご不明な点がありましたら、お問い合わせください。
*詳しい納期については各合成サービスの納期の表をご覧ください。
納期一覧表
3. オリゴヌクレオチドの品質管理はどのように行われていますか?
 ニッポンジーンではトリチル基の着色を確認することはもちろん、定量、質量分析装置によって分子量、完全長のオリゴと副産物について測定しています。また、Double-Dye Probeについては分析用HPLCによるQCも行っています。 全てのオリゴヌクレオチドの収量を測定した後、収量不足、または質量分析結果より私どもの基準に合わないと判定されたオリゴは即日再合成となります。それらの結果はお客様へ高品質なオリゴをお届けするためばかりでなく、今後も続けてそのような高品質の製品をお届けするための貴重なデータともなります。このような品質管理/フィードバックによって更なる品質の向上を目指しております。
4. 自分の注文したオリゴの配列が合成されたものと同じであるかを確認することはできますか?
 全てのオーダーはメールフォーム、ウェブフォームなどによってほぼ自動的にオーダーに組み込まれます。ファックスでのオーダーについては一日納期を頂き、万全を期してオーダーに組み込みます。合成機への配列の入力はLANを用いてオーダーと同時に行われます。LANは物理的に外部のネットワークから遮断されておりますので機密性の高い配列でも安心です。合成後に疑問が生じましても合成機の合成ログによって合成機がカップリングした塩基を確認することができます。
5. 自分の実験に使うオリゴヌクレオチドにはどのくらいの精製が必要なのですか?
 精製は大まかに分けて脱塩、カートリッジ精製、HPLC精製を用意しております。カートリッジにはShort Oligo用とLong Oligo用がございます。どの程度の精製が必要かは実験の目的によって大きく異なることが多いですが、簡単にまとめると下のようになります。
用途 精製
DNA増幅(PCR) 脱塩
マニュアルシーケンシング 脱塩
オートシークエンシング 脱塩、もしくは精製(カートリッジまたはHPLC)
ハイブリダイゼイションプローブ 35 mer以上は精製(カートリッジまたはHPLC)、34 mer以下は脱塩、もしくは精製(カートリッジまたはHPLC)
変異導入 精製(カートリッジまたはHPLC)
遺伝子合成 精製(カートリッジまたはHPLC)
DNA構造解析 精製(カートリッジまたはHPLC)
リンカー、アダプター構築 精製(カートリッジまたはHPLC)
6. HPLC精製はカートリッジ精製と比べてどの程度品質がよいのですか?
 HPLC精製は一般にカートリッジ精製より収率が高く、また同時に精製度についての詳細なレポートを記録することができるため、合成・精製過程における問題点も発見することができます。また、修飾オリゴの中にはカートリッジで精製することのできないものもあります(HEX-labelされたオリゴヌクレオチドなど)。
7. HPLC精製は必要なのですか?カートリッジ精製はどうですか?
 ニッポンジーンのオリゴは無料で脱塩されております。短いオリゴにはこの精製法が充分な精製度ですが、次のような場合にはHPLC精製が特に必要とされています。

・化学修飾されたオリゴ : HPLC精製は修飾されていない全ての非完全長オリゴと修飾基を取り除くことができます。DIG標識、ビオチン標識、蛍光標識の場合がこれに当てはまります。
・長鎖オリゴ : 合成は高いTurnoverで行われておりますので常に鮮度の高い試薬が用いられており、弊社の合成機を用いた場合、固相DNA合成のカップリング効率は99%以上です。この場合完全長のcrude 50merの収率は60%強、100merの場合約40%になります。これらの収率を同じカップリング効率で合成されたcrude 20mer(約83%)と比較すると短鎖オリゴは相対的に純度が高いことになります。このことより、カートリッジないしはHPLCによる精製は、短鎖の場合にはお使いになられなくてもPCRグレードには充分ですが、長鎖オリゴ(49~99mer)をご利用の際は精製が必要となります。長鎖オリゴ同様の理由で、弊社では35mer以上(収率約70%)のオリゴにはカートリッジ精製をご利用にいただきますようお勧めいたしております。
・アンチセンスDNA : アンチセンスDNAに不純物が混入しますと組織細胞の成育の阻害をまねき不正確な実験結果につながることがあります。アンチセンスDNAにはHPLC精製を行うのが良い選択肢と思われます。
・RNA : ニッポンジーンのRNA合成は高い品質を誇りますが脱保護などの工程で不純物のトレースが残る場合があります。HPLCによるRNAの精製は高い力価を得るためには必須であるといえます。
8. 長鎖オリゴをカートリッジ精製できますか?
 はい、できます。一般に長鎖オリゴ(49~99mer)はその鎖長に比べDMT基の結合が弱く充分な収量が得られない場合が多いのですが、ニッポンジーンではEurogentecとカートリッジメーカーが共同開発した長鎖オリゴ用のカートリッジ精製キットを用いてPAGE精製並みの精製度を得ております。
9. オリゴヌクレオチドの保存法について教えてください。
 ニッポンジーンでは、ほとんどのオリゴヌクレオチドを100μM水溶液品もしくは乾燥品として室温で発送しております。室温での輸送は品質に影響を与えませんが、お手元にお届き次第、凍結保存をしてください。
水溶液品については、凍結融解の繰り返しは絶対に避けるべきものと思われます。実験に必要な容量分を小分けにし、-20℃にて保存することをお勧めします。
10. 何merまでのオリゴヌクレオチドを合成することができますか?
 私どもの合成機のカップリング効率で理論的に計算しますと100merから200merまでの合成が精製の際の収率を考えても可能のように思えます。
しかしながらたとえ私どもで200merを合成し、収率よく精製を行ったとしても200mer合成には問題があるといわざるを得ません。合成サイクルのステップごとに塩基にダメージが加えられその数は塩基のカップル数に応じて増えていきます。この場合200回のサイクル分だけその確率が高くなるとお考えください。このような塩基への修飾・ダメージは変異を起こし、誤った塩基をコードする製品となります。この製品を取り除くような精製は一般には困難ですので、お客様のほうで長いオリゴを注文される場合はそれを考慮されてご注文いただければ幸いです。
現実的には200merを合成するのではなく、100merを2本合成、短い相補鎖を用いて2本のオリゴのライゲーションを行い200merを作成する方法が考えられます。必要に応じてこの長鎖にリン酸基付加を行うこともできます。
11. オリゴヌクレオチドの分子量はどのように計算していますか?
 次の式を用いてオリゴヌクレオチドの分子量を計算いたします。
(nA x 249.086189) + (nG x 265.081104) + (nC x 225.074955) + (nT x 240.074621) + (nD x 251.41397133) + (nM x 237.080572) + (nH x 238.07858833) + (nW x 244.580405) + (nR x 257.0836465) + (nY x 232.9120855) + (nV x 246.41408267) +(nS x 245.0780295) + (nK x 252.5778625) + (nN x 244.82921725) + (nB x 243.41022667) + (63.971417) x(Length - 1)) + 2.015650
ただし、 D=A/G/T, M=A/C, H=A/C/T, W=A/T, R=A/G, Y=C/T, V=A/C/G, S=C/G , K=G/T, N=A/G/C/T, B=C/G/T
12. オリゴヌクレオチドの融解温度(Tm)はどのように計算していますか?
 ここでのTm値は、修飾を持たない通常のホスホジエステル結合のDNA用に計算されています。この計算値は、ビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光色素、アミンといった修飾ヌクレオチドは考慮しておりませんが、実験条件を決める際の参考としてご参照ください。
Tm値はオリゴ水溶液のカチオン濃度やホルムアミドによって融解温度が左右されるため、特にTmの計算にはNa+カチオンを考慮に入れた次の式を用いております。
Tm=81.5 + 16.6log[Na+] (= ? 21.597098) + 0.41(%G + %C) -675/length
(Baldino et al. Methods in Enzymology. (1989), 168, 761-777).
弊社では[Na+]=50 mMとしてTm値を計算しております。お客様のほうで異なる計算式を用いる場合はその結果と合わないことがございます。実際に実験を行う時のリファレンスとしてご保管ください。
13. ニッポンジーンのオリゴの5'-, 3'-末端をキナーゼやターミナルトランスフェラーゼでラベルすることはできますか?
 はい、スタンダードオリゴはフリーの5'-、3'-水酸基を持ちますので5'-キナーゼによるラベル、あるいはヌクレオシド3-リン酸とターミナルトランスフェラーゼを使った3'-ラベリングも可能です。
14. 1オリゴ内にフォスフォロチオエートや2'-O-メチルなどのバックボーンや糖を同時に持たせることはできますか?
 はい、ニッポンジーンではノーマルバックボーン / フォスフォロチオエート、 mixed normal sugars / 2'-O-methyl sugars and mixed phosphorothioate / 2'-O-methyl sugarsを扱っております。
15. G-richなオリゴヌクレオチドは合成できますか?
 G-richなオリゴに関しては特別な合成法が必要となりますが、合成自体には問題はありません。その際、カートリッジ精製を行うことをお勧めいたします。
G-richなオリゴを取り扱う場合は同様に使用法にもご注意ください。G-richなオリゴは凝集し、テトラマー構造をとりやすく、このことが水溶液中で沈殿を生じる原因となります。これを避けるためにはバッファーに溶解させて相補するターゲット鎖を加えた状態で95℃まで温度を上げ、ゆっくりと温度を下げていく方法をとることもひとつといえるでしょう。
16. PNAとは何ですか?
 PNAはDNAの合成アナログで5炭糖‐リン酸バックボーンの代わりにペプチドのようなバックボーンを有しています。PNAのオリゴマーはそのバックボーンの構造よりDNA、RNAの相補鎖に対して非常に強く結合して2量体、3量体を形成するために高い特異性を持つプローブとして用いることができます。
PNAは化学合成分子ですので、核酸分解酵素によって分解・認識されません。
PNAは価を持ちませんので普通のオリゴヌクレオチドと比較してDNA, RNAとずっと強い複合体を形成します。低い塩濃度条件においても価を持たないPNAの結合は塩濃度条件とは無関係です。
結合エネルギーが高いため、PNAの長さは同じDNAオリゴマーに比べて制約があり、長いものを作ることができません。
PNAオリゴマーはビオチン、DIG、フルオレセインやそのほかのリポーター分子でラベルすることができます。
17. 凍結乾燥を行ったオリゴヌクレオチドの量を量る時は、秤で秤量してmgを出せばいいですか?それともODを見たほうがいいのでしょうか?
 私どもがお届けしているオリゴヌクレオチドのうち、大きなスケールでお届けする時には凍結乾燥を行い、またODを測定して収量をお知らせしています。私どもがmgで秤量しない理由として、DNAの凍結乾燥サンプルは水分をDNA duplex内のmajor groove, minor grooveに挟み込む形や塩基・糖・リン酸基への水和物として含んでいます。したがって、凍結乾燥品は実際には50%もの水分をその重量の中に含んでいるのです。それでも私たちが秤量する理由として、ODで測定した値と秤量値が大体あっているかをチェックするためです。もしODより予想できる値より秤量値が大きい場合には脱塩が充分でないことが示唆されます。その場合は改めてゲルろ過を行って脱塩を行い、秤量、OD値の測定を行っています。
18. スタンダードオリゴはPCR用ですか?
 はい、PCRに適しています。
19. ニッポンジーンで作ったプライマーでクローンを作ってシークエンスしたのですが、シークエンス結果を見ると注文したプライマー配列と違っていました。なぜですか?
 Taq DNA polymeraseを用いたPCR産物は0.25%のエラーを起こすことが知られており、また組換えベクター/宿主系の中で「self correcting」エラーが出るケースもあります。理論的には長い塩基を合成した場合にも合成サイクルの増加に伴ってプリン基などのダメージを受けることも考えられますが、Taq DNA Polymeraseを使われていないのにそのようなトラブルが起きました場合、直ちにお申し付けいただければ無料で再合成を行います。
20. 混合塩基はできますか?
 等モル混合塩基であれば3'末端、配列中を含めて可能です。
21. 修飾オリゴがスタンダードオリゴに比べて高いのはなぜですか?
 原材料が高価なことがまず一点、それに加えて修飾試薬の安定性が低く、長時間の保存が困難なことが最大の原因です。
22. なぜ0.2μmoleスケール合成の収量は0.05μmoleスケールの4倍ではないのですか?
 0.2μmoleスケールでの合成効率は0.05μmoleスケールの場合と必ずしも同じとは限らず、スタート時のモル数が4倍であっても収量も4倍になるとは限りません。
23. サービスの利用方法について
 カスタムオリゴヌクレオチド合成サービスのご利用方法についてはこちらをご覧ください。

質問 : Double-Dye Probeについて

23. 長期間保存してあったプローブを使用したところ、反応が起こらなくなってしまいました。
 プローブがしばらくの間、光などにさらされ色素が脱離してしまった可能性があります。この場合PCRの反応自体は進んでも蛍光色素がありませんのでデータを得ることはできません。蛍光色素などで修飾されたオリゴヌクレオチドは−20℃、冷暗所にて保存ください。凍結・融解の繰り返しは避けてください。
24. プローブのバックグラウンドがとても高いのですが。
 DNaseなどのコンタミネーションが起こりますとDNAの分解に伴って蛍光色素の脱離が起こり、高いバックグラウンドにつながります。オリゴヌクレオチドの分注の際には滅菌されたチップとチューブを使われてDNaseなどの混入を極力避けてご利用ください。
25. ダブルダイプローブを用いてマルチプレックス反応を行いたいのですが?
 一反応で複数の変異を検出する際にマルチプレックス反応は有用です。現在2種のターゲットを検出するのにもっとも頻繁に用いられている組み合わせがFAMとHEX(及びJOE、一般に高価)、Passive ReferenceとしてROXです。しかしながらFAM/HEXとFAM/JOEは感度が多少低いことが知られています。
EurogentecではVICTMやJOEに代わる色素としてYakima Yellow™を取り扱っております。Yakima Yellow™は蛍光強度、分光分解能、またコストの面で非常に優れております。蛍光強度の上昇によって、低いコピー数のampliconでも低いCt値(高い検出度)を得ることができます。
26. FITCオリゴヌクレオチドはFAMの代わりとなりますか?FITCのほうが安いと思うのですが。
 FITCオリゴはFITC(fluorescein isothiocyanate)ラベルをアミノリンカーで付加したオリゴです。この場合の問題点はまずfluoresceinは5-FAMと6-FAMの 2つのアイソマーの混合物であること、したがって泳動上で幅の広いバンドを示す可能性があることが挙げられます。また、フルオレセインとチオウレア基を持つオリゴヌクレオチドとの結合は不安定であり、これらの長期保存には問題があることがわかっています。