Ligation Pack

修飾酵素
品名 Code No. 包装単位 価格 備考
Ligation Pack 310-01471 100 回用 10,000円  

製造元 (株)ニッポンジーン

表示価格は希望納入価格 (税別) です。

製品説明

目的の遺伝子をベクターDNA と連結することは、遺伝子のクローニングを行う上で最初の重要なステップです。このパックにはDNAライゲーションに必要な試薬が全て含まれていますので、プラスミドベクターへのサブクローニング、ベクターDNA のリンカーライゲーションなど様々な実験に応じたライゲーション反応を組み立てることができます。

DNAライゲーションに必要なT4 DNA Ligase、ATP、DTT、反応バッファーなどがすべて一液に含まれているプレミックスタイプの製品もございます。→関連製品はこちら

特長

・ 独自の反応組成を自由に組み立てできる・ DNA ライゲーションに必要な試薬を全てパック化

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製品内容

Ligation Pack(100回用
構成品 容量 保存 備考
Enzyme Solution 100 µl -20°C 300 units/µl T4 DNA Ligase
10 x Ligation Buffer 1 ml -20°C 500 mmol/l Tris-HCl (pH 7.9), 100 mmol/l MgCl2, 200 mmol/l DTT, 10 mmol/l ATP
2 mg/ml BSA Solution 1 ml -20°C  
20 mM Spermidine-HCl 100 µl -20°C  
20 mM Hexamine Cobalt Chloride 100 µl -20°C 20 mmol/l Hexamine Cobalt Chloride (HCC)
ddWater 1 ml x 2 -20°C H2O

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使用例

l. ライゲーション反応のてびき

ある遺伝子をクローニングする際、全ての過程で高効率を得るにはある程度経験を積む必要がある。実験には、調製したベクターをクローニングしたいDNA 断片とどのような比で混合したらよいかなど試行錯誤的な要素が多い。このような場合、Revie, D2)らの報告は大変参考になる。

ligation

ll. Ligation Packの使用方法

反応の1 回分は、50 µl の体積でEnzyme Solution(T4 DNA Ligase)を1 µl 加える系を想定している。これらは通常、平滑末端ライゲーションが行える条件である。反応容量や、加えるEnzyme Solution の量は適宜変更することができる。Enzyme Solution は、Ligation Pack 専用に調製してある。

  1. <粘着末端ライゲーション>
    12 ~ 16°Cで30 分~ 16 時間反応する。高温(~ 37°C)では粘着末端のアニーリングが不十分となり、低温(~ 4°C)ではT4 DNA Ligase の活性を低下させる結果となる。通常、スペルミジンや塩化ヘキサアンミンコバルトを入れる必要はないが、塩化ヘキサアンミンコバルトがライゲーション効率を5 倍程度促進するという報告もある3)
  2. <平滑末端ライゲーション>
    粘着末端ライゲーションと異なりアニーリングさせる必要はないので、16 ~ 26°Cなどで反応させる。ただし、粘着末端ライゲーションに必要な酵素量の10 ~ 100 倍が必要である。Ligation Pack のEnzyme Solution は、1 µl で通常の平滑末端ライゲーションが行えるように調製してある。
    平滑末端ライゲーションは、スペルミジンや塩化ヘキサアンミンコバルト1)を加えると効率が促進される。これらの存在は、制限酵素反応を阻害しないので、例えばリンカーライゲーションの場合、ライゲーション反応後、T4 DNA リガーゼを熱失活させ、そのまま引き続いて制限酵素反応が行える。
  3. <その他の注意事項>
    ① T4 DNA Ligase の反応は、NaCl 150 mmol/l 以上の濃度で阻害されるので、DNA 溶液の塩濃度が高い場合は注意が必要です。
    ② BSA は、最終濃度50 ~ 250 µg/ml が適当です。

実験例1 Ligation Packの反応例

通常行われる条件を例としてあげた。特に効率が問題となる場合は、「l. ライゲーション反応のてびき」および「ll. Ligation Pack の使用方法」を参考にしてDNA 濃度、反応温度の検討が必要である。

1)ベクターDNA へのサブクローニング

  1. ベクターDNA(pUC, pBR など)を適当な制限酵素で切断、脱りん酸化し、除タンパク質後、TE バッファーに溶解する。
  2. クローニングしたいDNA 断片を精製し、TE バッファーに溶解する。
  3. ライゲーション反応を行う。
data1 data2

2)リンカーライゲーション

この反応は、リンカーDNA をDNA 断片の平滑末端にライゲーションさせることを目的としている。一般にリンカーDNA は、DNA 断片の10~20 倍程度のモル比で加え、以下のような反応系(10~20 µl)を用いる。

data3

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資料 Data Sheet

製品マニュアル

SDS(Safety Data Sheet)

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関連情報

備考

参考文献

関連製品

問い合わせ先

購入に関するお問い合わせ先
富士フイルム和光純薬株式会社および同社代理店・特約店
製品に関するお問い合わせ先
株式会社ニッポンジーン 学術営業課

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