CapSite Technology

Cap Site cDNA dT

製品説明

Cap Site cDNA dT(キャップサイトcDNA dT)は、真核生物のmRNAの5'末端に特徴的に存在するキャップ構造を合成オリゴリボヌクレオチドで置換した後、オリゴdTプライマーを用いて逆転写反応を行って得た第一鎖cDNAライブラリーです。
Cap Site cDNA dTを鋳型として、rOligo相補的配列部分に特異的なプライマーと解析したい目的遺伝子に特異的なアンチセンスプライマーを用いてPCRを行うことによって、高い効率で転写開始点を含む領域をクローニングすることができます(CapSite Hunting)。

特長


図1. Cap Site cDNA dT作製の原理

Cap Site cDNA dT作製の原理

真核生物のmRNA の5′末端はキャップ(m7Gppp)と呼ばれる特徴的構造を持っています。このキャップ構造は転写開始点(transcription start point : TSP、別名Cap Site とも呼ばれている)の塩基に転写後かなり早い段階で酵素的な修飾により形成されます。タバコ酸性ピロホスファターゼ(Tobacco Acid Pyrophosphatase:TAP)は、このキャップ構造を特異的に開裂します。そこで、まず高純度に精製したTAP によって、キャップ構造を開裂して生じる5′末端りん酸残基と特別に設計した合成オリゴリボヌクレオチド(rOligo)をT4 RNA リガーゼによって連結します。これを鋳型として、オリゴdTプライマーを用いて逆転写酵素によって第一鎖cDNA を合成します(図1)。このようにして得られたcDNA は、mRNA の5′末端側の情報に富んだcDNA です。

Cap Site cDNA dT を用いて高い効率で転写開始点を含む領域をクローニングし、その配列を決定することができます。この場合、Cap Site cDNA dT を鋳型としてrOligo 相補的配列部分に特異的なプライマー(添付)と、解析したい目的遺伝子に特異的なアンチセンスプライマーを用いてPCR を行います。この方法をCapSite Hunting と呼びます。CapSite Hunting はゲノム解析における発現遺伝子の転写開始点のマッピングや正確なコーディング領域の決定に有効な方法です。

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