- レーン1 : Marker 1(λ/Hind III digest) 0.2µg
- レーン2 : 毛髪 (毛根部1cm×3本)
- レーン3 : 爪 (1mm角×２個)
- レーン4 : 口腔粘膜(1)
- レーン5 : 口腔粘膜(2)
- レーン6 : 綿棒(1)
- レーン7 : 綿棒(2)
- レーン8 : ネガティブコントロール
- レーン9 : Marker 1(λ/Hind III digest) 0.2µg
ISOHAIRを用いて口腔粘膜よりゲノムDNAを抽出し、得られたDNAを鋳型としてPCRにてp53遺伝子(Exon 10 ;279bp)の増幅を行った。
(2)-1 : DNAの抽出
[試料]
[抽出方法]
試料
↓←Extraction Buffer 200µl*1
↓←Enzyme Solution 5µl
↓←Lysis Solution8µl
↓混合
↓インキュベート 55°C , 20分間
↓←Enzyme Solution 5µl
↓混合
↓インキュベート 55°C , 10分間
↓←フェノール/クロロホルム/(1:1) 200µl
↓転倒混合,5分間
↓遠心分離(11K×g , 室温 , 5分間)
水相(200µl)*2
↓←3M Sodium Acetate (pH5.2) 20µl
↓←Ethachinmate 2µl
↓混合
↓←エタノール 400µl
↓遠心分離(11K×g , 室温 , 15分間)
沈殿
↓70%エタノール洗浄
↓乾燥
↓←TE(pH8.0) 20µl
DNA溶液
*1 : 口腔粘膜(2)および綿棒(2)は綿棒が溶液を吸収してしまう為、約100µl程減少した。
*2 : 口腔粘膜(2)および綿棒(2)は液量が少ない為、水相85µlにTE 115µlを加えTotal 200µlとした。
上記方法にて抽出したＤNAを鋳型としてp53遺伝子(Exon 10 ;279bp)をPCRにて増幅した。
| Template DNA | 2µl |
| 10×Gene Taq Universal Buffer | 5µl |
| dNTP mixture (2.5mM each) | 4µl |
| Primer-forward (20pmol/µl) | 1µl |
| Primer-reverse (20pmol/µl) | 1µl |
| Gene Taq NT (5units/µl) | 0.5µl |
| H2O | 36.5µl |
| Total | 50µl |
| 94°C | 1分間 | |
| 94°C | 30秒間 | 35サイクル |
| 55°C | 30秒間 | |
| 72°C | 1分間 | |
| 72°C | 5分間 | |
(3)-1 : ISOHAIRを用いて毛髪(毛根部)、爪、口腔粘膜より得られたDNA溶液の1/4量をアガロースゲル電気泳動にて泳動した。
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