| トラブル | 原因 | 対策 | |
|---|---|---|---|
| (A) PCRで全く増幅産物が得られない。 | I.プライマ−の設計が適当でない。 | 新しく設計する。 | |
| II.プライマ−の純度が低い。 | プライマ−を合成し直す。その際、 PAGE精製等を行って純度を上げる。 | ||
| III.Gene Taqの活性が低下している。 | 添付のControl Primerを用いた場合の増幅効率が本品購入時と比べて低下している場合、新しいGene Taqを購入することを勧める。 | ||
| IV.Gene Taq (添付) を使用していない。 | 本品は、Gene Taq (添付) を使用することで、良い結果が得られるように開発されているため、Gene Taqを使用する。1000bp以上のDNAを増幅する場合には、Gene Taq NT (あるいはnative formのTaq DNA polymerase) も使用できる。 Thermus aquaticus由来以外及び混合型のDNApolymeraseの使用は、著しく増幅効率を低下させるので使用してはいけない。 | ||
| V.反応例通りに行わなかった場合 | 反応液の調製が氷冷下で行われていなかった。 | PCR反応液の調製を氷冷下で行う。この時使用する試薬、試料、PCRチュ−ブ等をあらかじめ氷冷しておく。 | |
| 反応液の調製及び血液試料添加の際、ボルテックス等の激しい撹拌操作をした。 | PCR反応液はピペッティングにて穏やかに混合する。また、血液試料は、液面に載せるようにできるだけ静かに添加する。血液試料は、添加後チュ−ブの底に沈むが、撹拌してはいけない。 (血液試料添加後に撹拌すると、反応液中に含まれるPCR阻害緩和物質の効果が十分発揮される前に、血液試料中のPCR阻害物質が酵素の働きを不可逆的に阻害してしまうことが考えられる。) |
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| 増幅断片が長すぎる。 | 添付のGene Taqは、主に1,000 bp以下の増幅に適しており、2,000 bp以上は増幅が困難になる。また、1,000〜2,000bpを増幅したい場合、酵素量を増やす(5〜15 units)ことで増幅できることがある。(デ−タ集4.参照) 1,000bp以上のDNAを増幅させたい場合には、Gene Taq(添付)の添加を80°C, 15 min.の前処理後に行うと効果的である。また、Gene Taq NT (別売)を使用することで増幅できることがある。 |
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| 血液試料の添加量が多すぎる。 | 添加する血液試料はできるだけ1 µl以下にする。1 µl以上の血液試料を添加しても増幅効率が良くならないことが多く、試料によっては酵素反応を阻害する場合がある。 | ||
| 前処理を行わなかった。 | 前処理にはPCR阻害物質を不活化する効果があるので、必ず行うようにする。 | ||
| PCRのサイクル数が少ない。 | 血液試料を直接PCRするため、1サイクルあたりの増幅効率は、精製DNAを使用した場合より低い。本品にはTaq DNA polymeraseの熱安定化剤が含まれているので、通常よりもサイクル数を増やすことが可能である。従って、35〜40サイクル程度で行う。 | ||
| (B) エクストラバンドが現われる。 | アニーリング温度が適当でない。 | 反応液中にTaq DNA polymeraseを活性化させる物質が含まれており、副産物が生じやすくなっている。PCR反応液を調製する際の注意事項を守ると共に、アニ−リング温度を3〜5°C高めに設定すると良い結果が得られる場合がある。 | |
| (C) PCR反応液中に浮遊物がある。 | 血液試料をPCR反応液に添加後、撹拌した。 | 血液試料をPCR反応液に添加する際には、液面に載せるように静かに行う。添加した血液試料は静かにチュ−ブの底に沈むが撹拌してはいけない。また、浮遊物が電気泳動パタ−ンを乱す原因となることがあるので、遠心して除去した後上清を使用する。 | |
| (D) 電気泳動パターンが乱れている。 | I.SDSの入っているLoading Bufferを使用した。 | 本品を用いて得られたPCR産物を電気泳動する場合、SDSが混入していると電気泳動パタ−ンが極端に乱れる。添付のLoading Buffer (-SDS) を使用する。 | |
| II.PCR後の反応液中に浮遊物がある。 | (C) の対策を参照。 | ||
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