| Drop A | |
| Drop B | |
| dNTP Mixture | |
| † | Primer forward*1) |
| † | Primer reverse*1) |
| Gene Taq | |
| † | ddH2O |
| † | 血液試料 |
| † | PCRチューブ |
| †は、キットに含まれていなので、実験時に準備する必要がある。 *1) 添付のControl Primerは、forwardとreverseの混合液である | |
室温でPCR反応液を調製すると増幅効率が低下する。
| Drop A | 10 µl |
| Drop B | 10 µl |
| dNTP Mixture (2.5mmol/l each) | 4 µl |
| Primer forward (20 pmol/µl) | 1 µl*2) |
| Primer reverse (20 pmol/µl) | 1 µl*2) |
| Gene Taq (5 units/µl) | 0.5 µl (2.5 units) |
| ddH2O | up to 50 µl |
*2)添付のControl Primerは、forwardとreverseの混合液 (20 pmol/µl each) になっているので1 µlを加えるだけでよい。 Control Primerを使用する場合は、【Control Primer (添付) を用いたPCR反応条件】を参照。
PCR反応液は、PCR反応チューブ数本分をまとめて調製してもよい。この場合、PCR反応液をPCRチューブ1本あたり50 µlずつ分注して使用する。(図1,(b))血液試料は、PCR反応液を分注後添加する。
血液試料の添加は増幅効率に影響を及ぼすため、注意深く慎重に行う。
血液試料添加後に撹拌すると、反応液中に含まれるPCR阻害緩和物質の効果が十分発揮される前に、血液試料中のPCR阻害物質が酵素の働きを不可逆的に阻害することが考えられる。
| 4°C (あらかじめ冷却しておく) |
| 80°C, 15min. |
| 94°C, 4.5min. |
この前処理は増幅効率に大きく影響するので必ず行う。
| 98°C 10 sec. | |
35〜40cycles |
| アニーリング温度*3) 20 sec. | ||
| 72°C 2 min. | ||
| 72°C 5 min. | ||
*3) 添付のControl Primerを使用する際は65°Cでアニ−リングを行う。[Control Primer (添付) を用いたPCR反応条件]を参照。
アニ−リング温度は、プライマ−のTm値をもとに設定する。エクストラバンドが現れる場合は、アニ−リング温度を3〜5°C程度高くするとよい。増幅効率が悪い場合は、伸長時間を長くすると増幅することがある。
上清にチュ−ブの底に沈んでいる血液あるいはPCRで生じた沈殿物が混入していると、電気泳動パタ−ンが乱れることがあるので注意する。また、SDSも電気泳動パタ−ンを乱す原因となるので、SDSを含まないLoading Bufferを使用する。PCR産物を用いて酵素反応を行う場合は、フェノ−ル/クロロホルム処理等による精製が必要である。
| Drop A | 10 µl |
| Drop B | 10 µl |
| dNTP Mixture (2.5 mmol/l each) | 4 µl |
| Control Primer (forward and reverse, 20 pmol/µl each) | 1 µl |
| Gene Taq (5 units/µl) | 0.5 µl (2.5 units) |
| ddH2O | up to 50 µl |
| 4°C (あらかじめ冷却しておく) |
| 80°C, 15min. |
| 94°C, 4.5min. |
| 98°C 10 sec. | |
35cycles |
| 65°C 20 sec. | ||
| 72°C 2 min. | ||
| 72°C 5 min. | ||
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