PCR終了後そのまま電気泳動できるコロニーPCR用キット
| Code No. | 製品名 | 希望納入価格 |
|---|---|---|
| 316-05351 | Colony PCR M13 SET (120回用*) | 30,000円 |
本製品はコロニーPCRを迅速に行うためのセットです。2×PCR MixにはGene Taq NT(Taq DNA polymerase)、dNTP、反応Bufferがそれぞれ2倍濃度で含まれています。また、2×M13 primer Mixには汎用性の高いM13プライマーが2倍濃度で含まれています。よって、2×PCR Mixと2×M13 primer Mixを等量混合し、コロニーを直接添加してPCRをするだけでM13系ベクターのインサートチェックを行うことができます。
さらに、2×PCR MixにはGlycerolが、2×M13 primer MixにはLoading Dye(Bromophenol Blue)が含まれているので、PCR終了液をそのまま電気泳動ゲルにアプライすることができ、迅速・簡便にインサートチェックを行うことができます。
このように、Colony PCR M13 SETはコロニーPCRを行う際の煩雑な操作を簡略化することができ、多数のサンプルを処理する際に有効です。
また、Taq DNA polymeraseとprimerが別々に分注されているので、2×PCR Mixは通常のPCR Pre-Mix溶液として使用することができ、M13系ベクターのインサートチェックだけでなく、様々な使用方法に幅広く対応できるセット構成になってい ます。*通常50µlの系でPCRを行った場合、１製品がPCR約120回分に相当します。
1) 2×PCR Mix 2.5units/25µl Gene Taq NT, 2×Gene Taq Universal Buffer (15mM Mg2+), 0.4mM dNTP each, 10% Glycerol, 2mM Dithiothreitol
2) 2×M13 primer Mix 0.8pmol/µl M13 forward primer, 0.8pmol/µl M13 reverse primer, 0.1mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.01% Bromophenol Blue
3) Control DNA solution 0.1ng/µl control DNA
*通常50µlの系でPCRを行った場合、１製品がPCR約120回分に相当します。
-20°C保存
凍結融解により反応性が低下する恐れがありますので、融解後はチューブに小分けし、-20°Cでの保存をお勧めします。
2×PCR Mixは使用期限内にご使用下さい。使用期限を過ぎた場合はコロニーPCRの増幅効率が低下する場合があります。
使用期限は購入後３ヶ月〜６ヶ月となっています。
大腸菌プラスミドのインサートチェック
PCR溶液調製 PCR条件
2×PCR Mix 2×M13 Primer Mix コロニー Total
94°C 94°C 55°C 72°C
*インサート1kbpあたり1min.を目安として下さい。1kbp以下の場合は1min.として下さい。
1. 必要本数分の2x PCR Mixを1.5mlチューブに分取する。
2. 2x M13 primer Mixを等量添加する。
3. 50µlずつPCRチューブに分注する。
4. 爪楊枝またはチップでコロニーを軽く突き、3の反応液中で懸濁する。(注1.2)
5. 直ちにPCR反応を行う。
6. PCR後、各反応液の一部をそのまま電気泳動ゲルにアプライし電気泳動でチェックする。(Loading DyeとGlycerolが既に含まれているため、PCR終了後、反応液をそのまま電気泳動ゲルにアプライできます。電気泳動用bufferはTAE buffer、TBE bufferのどちらでも使用可能です)注1) コロニーを多量に持ち込んだ場合、PCR反応を阻害する恐れがあります。
注2) 爪楊枝を10秒以上反応液に浸した場合、反応液が爪楊枝に吸収されることがあります。
M13 forward primer GTTTTCCCAGTCACGACGTT
M13 reverse primer GGAAACAGCTATGACCATGAM13 forward primer
5' AAGTTGGGTA ACGCCAGGGT TTTCCCAGTC ACGACGTTGT AAAACGACGG CCAGTGCCAA
3' TTCAACCCAT TGCGGTCCCA AAAGGGTCAG TGCTGCAACA TTTTGCTGCG GGTCACGGTT
5' GCTTGCATGC CTGCAGGTCG ACTCTAGAGG ATCCCCGGGT ACCGAGCTCG AATTCGTAAT
3' CGAACGTACG GACGTCCAGC TGAGATCTCC TAGGGGCCCA TGGCTCGAGC TTAAGCATTA
5' CATGGTCATA GCTGTTTCCT GTGTGAAATT GTTATCCGCT CACAATTCCA CACAACATAC
3' GTACCAGTAT CGACAAAGGA CACACTTTAA CAATAGGCGA GTGTTAAGGT GTGTTGTATG
M13 reverse primer
pUC18/19 121 bp pGEM°-T easy 250 bp pT7Blue2 388 bp pBluescript°II 247 bp pT7Blue 172 bp λZAP°II 244 bp
各種インサート長プラスミドをDH５αを用いて形質転換し、生じたコロニーについて、本品を用いてコロニーPCRインサートチェックを行った。
PCR終了液5µlをそのままAgarose S 0.8% gelにアプライし、電気泳動を行った。
Lane No. Vector Insert Length (bp) Total Length (bp) 1 pBluescript°II 2 pUC19 3 4 5 6 7 8 9 Marker(Smart Ladder 0.2-10kbp)
「結果」 419〜4431bpまでの増幅サイズ全てにおいて、良好な結果が得られた。
pUC19、pBluescript®II、pGEM®-T easyベクターに 499bp のDNA 断片を挿入し、DH５αを用いて形質転換し、生じたコロニーについて、本品を用いてコロニーPCR インサートチェックを行った。
PCR終了液5µlをそのままAgarose S 0.8% gelにアプライし、電気泳動を行った。
Lane No. Vector Insert Length (bp) Total Length (bp) 1 Marker(Smart Ladder 0.2-10kbp) 2 pUC19 3 4 5 pBluescript(R)II 6 7 8 pGEM(R)-T easy 9 10
「結果」 全てのベクターにおいて、良好な結果が得られた。
50µlスケールのコロニーPCRインサートチェックにおいて、コロニー持ち込み量を変化させて、コロニーPCRでのDNA増幅量を確認し た。本実験には、pUCベクターに1309bpのDNA断片を挿入してDH5αを用いて形質転換を行い、生じたコロニーを使用した。増幅され るDNAサイズは1430bpとなる。
Lane No. Sample 1 Marker(Smart Ladder 0.2-10kbp) 2 コロニー少量* 3 4 コロニー多量** 5
*コロニー多量 少量：爪楊枝またはチップでコロニーを軽く突き、PCR反応液中に懸濁。
** 多量：爪楊枝またはチップでコロニーを多量にかき取り、PCR反応液中に懸濁。「結果」 多量のコロニーを鋳型に使用しても増幅DNA量は多くはならず、むしろ増幅量が少なくなったり、バンドがスメアーになった。本実験により、コロニー持ち込 み量は少量の方がよいことがわかる。また、本実験は50µlスケールの結果であるが、20µlや10µlなどPCR スケールを小さくするほど、コロニー持ち込み量の悪影響が強くなる。
問題 原因 対策 増幅しない
増幅効率が悪い菌体、培地の持ち込み量が多い
インサートのGC含量が高い
伸長時間が短い菌体、培地の持ち込み量を減らす
変性温度を上げてみる
インサート1kbpあたり1min.を目安に伸長時間を延ばすバンドがスメアーになる 菌体、培地の持ち込み量が多い
PCRサイクル数が多い菌体、培地の持ち込み量を減らす
サイクル数を減らす(〜25cycles)エキストラバンドが出る 菌体、培地の持ち込み量が多い
アニーリング温度が低い菌体、培地の持ち込み量を減らす
2°Cずつ上げてみる
Code No. 製品名 容量 希望納入価格 314-00994 pUC18 DNA 310-00996 311-01004 pUC19 DNA 317-01006 314-01871 pMW118 DNA 313-01581 pMW119 DNA 317-02601 pMW218 DNA 310-02571 pMW219 DNA 318-03231 Gene Taq NT 314-03233 317-03941 Smart Ladder(0.2-10kbp) Size & Mass 313-05241 OneSTEP Ladder 100(0.1-2kbp) 319-05243 310-05251 OneSTEP Marker 1 (λ/Hind III digest) 316-05253 311-05281 OneSTEP Marker 6 (λ/Sty I digest) 317-05283 312-01193 Agarose S 313-90035 50×TAE 318-90041 5×TBE 315-90051 EtBr Solution
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