図5 プライマーの位置関係
以下は、本品に添付しているControl Primer1, 2を用いて、Cap Site cDNA®, Human Testis、Cap Site cDNA®, Mouse Testis、Cap Site cDNA®, Rice Shoot(Dark) を鋳型としてコントロール遺伝子のCapSite® Huntingを行った結果である。コントロール遺伝子及びプライマーの位置関係は下記の通りである。PCR条件はマニュアルの反応例に従った。lane 2はControl Primer2(添付)及びrOligo相補的配列部分に特異的である2RC Primer(添付)を用いたnested PCRである。lane 3はコントロール遺伝子特異的プライマーのアンチセンス鎖としてControl Primer2、センス鎖としてコントロール遺伝子の翻訳開始点付近に設計したControl Primer-Senseを用いたPCRである。lane 3はlane 2のポジティブコントロールに相当する。
| Cap Site cDNA® | コントロール遺伝子 |
|---|---|
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Human Testis Mouse Testis Rice Shoot (Dark) |
β-アクチン β-アクチン アクチン-1 |
| Human Testis | Mouse Testis | Rice Shoot (Dark) |
|---|---|---|
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PCR産物の1/10量 (5µl) を3% Agarose 21で電気泳動
ヒト胎盤性ラクトゲン(hPL)は、ヒト胎盤で特異的に発現する成長ホルモン遺伝子ファミリーに含まれる分子量22kDaのペプチドホルモンで、第17染色体上に遺伝子クラスターを形成している9)。ヒト胎盤で発現しているhPLは、hCS-AとhCS-Bが主で、生化学的に全く区別がつかないほど配列が似ている。また、hCS-A遺伝子の転写開始点が2つあることが田中らによって報告されている10)。そこで、Cap Site cDNA®, Human Placentaを用いて、hPLのCap Siteを解析した。マニュアルの反応例に従って得たPCR産物の塩基配列を決定したところ、2つの転写開始点を同定できた。
トランスフェリン受容体遺伝子のCapSite® HuntingをCap Site cDNA®, Human Placentaを用いて行った。マニュアルの反応例に従って得たPCR産物の塩基配列決定の結果、既に報告されている転写開始点と一致することを確認した。
Cap Site cDNA®, Mouse Testisを用いて、β-アクチン遺伝子のCapSite® Huntingを行った。添付のControl Primer1および2をTGP1および2として使用し、マニュアルの反応例に従って転写開始点を決定した。nested PCRで得られたクローンの塩基配列を決定したところ、報告されている転写開始点と同じ位置(翻訳開始点より80ヌクレオチド上流)に転写開始点を決定することができた。β-アクチン遺伝子はα-アクチン遺伝子あるいはγ-アクチン遺伝子と配列の相同性が非常に高いため、β-アクチン遺伝子と共にα-アクチン遺伝子およびγ-アクチン遺伝子のCapSite® Huntingを行うことができた。nested PCRで得られたそれぞれ3個のクローンの塩基配列を決定したが、α-アクチンおよびγ-アクチン共に報告されている配列よりも上流から転写されていた。
1) Chen, E. Y., Lio. Y-C., Smith, D. H., Barrera-Saldane, H. A., Celinas, R. E. and Seeburg, P. H.:Genomics, 4 (4), 479-497 (1989)
2) Tanaka, M., Masuda, N., Watahiki, M., Yamakawa, M., Shimizu, K., Nagai, J. and Nakashima, K.:Biochem. Int., 16 (2), 287-292 (1988)
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