Sample (1.5 ml culture)
↓遠心分離 (6K×g, 室温, 5分間)
沈殿
↓←Solution I, 300 µl*1)
↓ボルテックス*2)
↓←Solution II, 150 µl*3)
↓ボルテックス, 10秒間
↓50°C, 10分間*4)
↓←Solution III-A, 100 µl*5)
↓←Solution III-B, 120 µl
↓ボルテックス, 1〜2秒間
↓氷上, 10分間
↓遠心分離 (14K×g, 4°C, 10分間)
水相*6)
↓←2倍量エタノール(室温保存)
↓混合
↓遠心分離 (6K×g, 室温, 5分間)
沈殿*7)
↓←70% エタノール, 1 ml
↓混合
↓遠心分離 (6K×g, 室温, 1分間)
沈殿
↓風乾*8)
↓←TE (pH 8.0), 1 ml
DNA溶液*9)
*1) Solution I中に白い結晶が現れることがある。このような場合には、 50°C程度の湯浴中で結晶を完全に溶解した後、内容物が均一になるよう撹拌してから使用する。
また、Solution Iにはタンパク質変性等が含まれているので、取り扱いには注意する。目に入ったり、皮膚に付着した場合には直ちに多量の水で十分に洗い流す。
*3) 本品に含まれるSolution IIの主成分は塩化ベンジルである。塩化ベンジルは消防法により危険物に指定されているので、取り扱いの際には注意が必要である。(詳細は製品添付マニュアルp.3 IV使用上の注意参照)目や皮膚等に付着した場合には、ただちに以下の処置を行う。
なお、異常が認められた場合には、ただちに医師の診察を受ける。
*4) Solution IIの主成分である塩化ベンジルによって細胞壁、細胞膜、核膜等が破壊され、DNAが水相に溶け出す。
*5) Solution III-Aは、使用前によく振り均一にした後、先を切ったチップで吸う。
*6) 有機相の塩化ベンジルや遠心後に認められる白い固形物等、水相以外の物質ができるだけ混入しないようにする。水相以外の物質が混入してしまった場合には、再度遠心操作を行い、水相のみを採取する。
*8) 沈殿を完全に乾燥すると非常に溶解しにくくなるので、乾燥し過ぎないように注意する。
*9) 溶液に溶解しない物質がある場合には、氷上にてしばらく静置してDNAを溶解させた後、軽く遠心して上清を使用する。DNA溶液中のRNAを除く場合には、添付のRNase Aを終濃度10〜20µg/mlになるように加えて、37°Cにて30分間反応させる。必要があれば反応終了後、フェノール／クロロホルム処理を行う。(製品添付マニュアルp.8 VIトラブルシューティング参照)
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