Sample*1)
↓
↓←Solution I, 300 µl*2)
↓ボルテックス, 1〜2秒
↓←Solution II, 150 µl*3)
↓ボルテックス*4), 5〜6秒
↓インキュベート, 50°C, 15分*5)
↓←Solution III, 150 µl*6)
↓ボルテックス, 1〜2秒
↓氷上, 15分*7)
↓遠心分離(12K×g, 4°C, 15分)
水相*8)
↓←2〜2.5倍量エタノール*9)
↓混合
↓遠心分離(12K×g, 4°C, 10分)
沈殿*10)
↓70%エタノール洗浄
↓乾燥*11)
↓←TE (pH 8.0), 50 µl
DNA溶液*12)
*1)植物の場合0.01〜0.1gをはさみで3〜5mm角に切って使用する。植物の種類によって体積が異なるが、Solution IIを入れた際、下層(Solution III)に試料が完全に浸るようにした方が良い。
また、できるだけ新鮮な試料を用いるようにする。凍結保存でも長時間にわたる場合には、DNAの回収率が低下することがある。
酵母、細菌等の場合には、1.5ml cultureを遠心して得られた沈殿 (〜0.03g) を用いる。
*2)Solution IにはSDSが含まれているので、低温で保存すると白い結晶が現れることがある。このような場合には37°C程度の湯浴にて完全に溶解させてから使用する。
*3)本品に含まれているSolution IIの主成分は塩化ベンジルである。塩化ベンジルは消防法により危険物に指定されているので、取り扱いの際には注意が必要である。(詳細は使用上の注意を参照)
目や皮膚等に付着した場合には、ただちに以下の処理を行う。
*5)Solution IIの主成分である塩化ベンジルによって、細胞壁、細胞膜、核膜等が破壊され、DNAが水相(界面活性剤をふくんでいる Solution I)に溶け出す。植物試料の場合には、通常、形態の変化は目で確認できない。
*6)Soluiton IIIを入れることにより、白濁が起こる。
*8)有機相の塩化ベンジルや遠心後に認められる白い固形物等、水相以外の物質ができるだけ混入しないようにする。水相以外の物質が混入してしまった場合には、再度遠心を行い、水相のみを採取する。DNAの物理的切断を防ぐため、ピペットチップの先端はカットして使用する。
*9)PCRや制限酵素反応がうまく行かない場合には、エタノール沈殿を2回行うと改善されることがある。
エタノール沈殿を行う際には、−20°Cに冷却したエタノールを使用し、添加後ただちに遠心する。−20°Cの静置を長時間行った場合、夾雑物が沈殿する原因となる。
*10)DNAの沈殿は目に見えないことがある。
試料の種類により、DNA以外の沈殿が生じることがある。例えば、イネの場合には茶色の沈殿、ホウレンソウの場合にはDNAと異なる白い結晶状の沈殿が生じることがある。
*11)沈殿を完全に乾燥すると非常に溶解しにくくなるので、乾燥しすぎないように注意する。
*12)DNA以外の沈殿があった場合(*10)参照)、DNAとともにTEに溶解させて使用する。溶解しない場合には、氷上でしばらく静置してDNAを溶解させた後、軽く遠心して上清を使用する。なお沈殿に茶色い着色が認められる場合には、トラブルシューティングを参照する。DNA溶液中のRNAを除く場合には、添付のRNase Aを1µl(終濃度 10〜20µg/ml になるように)加えて、37°Cにて30分反応させる。必要があれば反応終了後、フェノール/クロロホルム処理を行う。
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