| Code No. | 製品名 | 包装単位 | 希望納入価格 |
|---|---|---|---|
| 314-05651 | ISOGEN Poly(A)+ Isolation Pack | 20回用 |
50,000円 |
| 311-05661 | ISOGEN-LS Poly(A)+ Isolation Pack | 20回用 |
54,000円 |
ISOGEN Poly(A)+ Isolation Packは、ISOGEN(Code No.311-02501)またはISOGEN-LS(Code No.311-02621)とPoly(A)+ Isolation Kit from Total RNA (Code No.317-05641)をセットにしたパッケージです。
本品によって、RT-PCRはもちろんのこと、ノーザンハイブリダイゼーションにも使用可能な高純度のPoly(A)+ RNAを短時間で得ることができます。
また、Ethachinmateも添付されており、溶出したPoly(A)+ RNAの濃縮などに大変便利です。
[ISOGEN Poly(A)+ Isolation Pack]
品名 数量 ISOGEN 100ml×1本 Poly(A)+Isolation Kit from Total RNA 1キット [ISOGEN-LS Poly(A)+ Isolation Pack]
品名 数量 ISOGEN-LS 100ml×1本 Poly(A)+ Isolation Kit from Total RNA 1キット [Poly(A)+ Isolation Kit from Total RNA]
品名 数量 Oligotex™-dT30＜Super＞ 300µl 2×Binding buffer 5 ml Wash buffer 20 ml DEPC treated Water 10 ml スピンカラムセット 20 セット スピンカラム用遠心チューブ 40個 Ethachinmate 60µl 3M Sodium Acetate 300µl
2〜8°Cで保存して下さい。
輸送は室温で行いますが、Solution Setは到着次第4°Cに保存して下さい。注意 : Oligotex™-dT30＜Super＞は絶対に凍結させないでください。
1.Total RNAの抽出
Total RNAはISOGENまたはISOGEN-LSでの調製をお勧めします。Total RNAの調製はISOGENまたはISOGEN-LSに付属のマニュアルを参照して下さい。
ISOGEN/ISOGEN-LSを用いたRNAの抽出
ISOGEN/ISOGEN-LSを用いた微量試料からのRNAの抽出
ISOGEN/ISOGEN-LSを用いたRNAの抽出2.Total RNA溶液の調製
Total RNA溶液は、以下の容量になるようにDEPC処理水を用いて調製して下さい。(この時使用するチューブは、本キット以外に別途準備して下さい。)
3.Poly(A)+ Isolation Kit from Total RNA使用前の準備
Oligotex™-dT30＜Super＞を37°Cに保温して下さい。 2×Binding bufferに析出がみられる場合は、37°Cに保温し完全に溶かして下さい。 ヒートブロックを70°Cに設定して下さい。 溶出するときに使用するDEPC処理水を70°Cに保温して下さい。
4.Poly(A)+ RNAの精製
Total RNA：200 µl
↓←2×Binding Buffer, 200 µl
↓←Oligotex™-dT30<Super>, 10 µl(Total RNA, 100 µg以下) or 15 µl(Total RNA, 100〜250 µg)
↓加熱(70°C, 5分)(RNAの変性)
↓静置(室温, 10分)(Oligotex™-dT30<Super>とPoly(A)+ RNAとのハイブリダイゼーション)
↓遠心分離(12,000rpm, 5分)
沈殿(注1)
↓←Wash buffer, 350 µl
↓懸濁(注2)してスピンカラムに移す
↓遠心分離(12,000rpm, 1分)
沈殿(フィルターカップにOligotex™-dT30<Super>-Poly(A)+ RNA複合体が残る)
↓フィルターカップをキット付属の新しいチューブに入れる
↓←Wash buffer, 350 µl
↓懸濁(注2)
↓遠心分離(12,000rpm, 1分)
沈殿(フィルターカップにOligotex™-dT30<Super>-Poly(A)+ RNA複合体が残る)
↓フィルターカップをキット付属の新しいチューブに入れる
↓溶出(DEPC処理水(70°Cで保温しておいたもの)に懸濁し遠心分離(12,000rpm, 1分))(2〜3回)
Poly(A)+ RNA
- 注1：Poly(A)+ RNAが得られるまで、この時点での上清を保存しておくとよい。
- 注2：Oligotex™-dT30＜Super＞の固まりが完全に無くなるまで、完全に懸濁する。
- 注3：溶出を繰り返し行うことで、Poly(A)+ RNAの回収量は多くなるが、濃度は薄くなる。この時、使用目的に応じて付属のEthachinmateを用いてエタノール沈澱を行い、Poly(A)+ RNAを効率よく濃縮することができる。Ethachinmateを用いることで、-80°Cでのインキュベートが不要になり、沈澱を目で確認できる。また、エタノール沈殿でのPoly(A)+ RNAの回収率を上げることができる。
製品マニュアルをご覧になる際にはAdobe Acrobat® ReaderまたはAdobe Acrobat® Reader Plug-inが必要です。
ISOGEN : 平成10年10月16日改訂版
マウスの脳よりISOGENを用いてTotal RNAを抽出し、Poly(A)+Isolation Kit from Total RNAを用いてPoly(A)+ RNAを精製、濃縮した。得られたPoly(A)+ RNAについて、以下の方法でUtrophin遺伝子(約11kb)の検出を行った。
(1)RT-PCR RT-PCR によって、Utrophin遺伝子(約11kb)の 5'末端側(1153 base)を増幅した。その結果、目的とするサイズの増幅産物を得られた。
Lane 1：Marker(OneSTEP Ladder 100)
Lane 2：RT-PCR増幅産物(2)ノーザンハイブリダイゼーション Utrophin遺伝子の 5'末端側に特異的なRNAプローブを用いてノーザンハイブリダイゼーションを行ったところ、所定のバンド位置にUtrophin遺伝子が検出された。
Lane 1：Total RNA 1µg
Lane 2：Poly(A)+ RNA 1µg(3)Poly(A)+ RNAの回収(エタノール沈殿の際のEthachinmateの効果) Total RNA 150 µg(ISOGENで抽出)を用いて、Poly(A)+ RNAを精製した。エタノール沈殿により濃縮し、得られたPoly(A)+ RNAの収量を260 nmの吸光度を用いて測定した。
試料 Total RNA量 回収したPoly(A)+ RNA量 Ethachinmate : 有 Ethachinmate : 無 Mouse Brain Mouse Kidney Mouse Liver Mouse Testis Mouse Thymus
1.Total RNAの抽出
ISOGEN及びISOGEN-LSのトラブルシューティングページをご覧下さい。
ISOGEN, ISOGEN-LS トラブルシューティング(RNAの単離)2.Poly(A)+ RNAの精製
現象 考えられる原因 対策 カラムが詰まる Total RNAの量が多すぎる 使用するTotal RNAは250µgまでにする Total RNAに夾雑物が多量に含まれている Total RNAの精製にはISOGENまたはISOGEN-LSを使用する Poly(A)+RNAの回収率が悪い 溶出の時の液量が少なすぎる 溶出の液量を増やすか、回数を増やす 溶出のときに使用するDEPC水の温度が低い DEPC水を70°Cに温めておき、遠心前にOligotex-dT30を完全に懸濁する エタノール沈澱の時にロスをした Ethachinmateを使用してエタノール沈殿を行う Poly(A)+RNAが分解している RNaseが混入した 使用する器具はRNA専用のものを使用する rRNAの混入 洗浄操作が不十分 洗浄の際、Oligotex™-dT30の懸濁を完全に行う
品名 Code No. 包装単位 希望納入価格 Poly(A)+ Isolation Kit from Total RNA 317-05641 ISOGEN 317-02503 311-02501 ISOGEN-LS 311-02621 Ethachinmate 312-01791 DEPC treated Water 314-90205 Deoxyribonuclease(RT Grade) 313-03161 SP6 RNA Synthesis Set 313-02441 T3 RNA Synthesis Set 310-02451 T7 RNA Synthesis Set 317-02461
