以下の操作は、RNaseのコンタミを防ぐとともに安全のために手袋を着用し、清潔な環境で行う。なお、クロロホルム、イソプロパノール及びエタノールは別に準備しなければならない。また、チューブは透明なポリプロピレン製を用いるとよい。
sample*1)
(for ISOGEN:50-100mg tissue, 10cm2 of culture plate, 5-10×106 cells)
(for ISOGEN-LS:0.25ml liquid sample)
↓ add 1ml of ISOGEN or 0.75ml ISOGEN-LS
↓ lysis or homogenization*2)
↓ store for 5min. at room temperature*3)
↓ add 0.2ml of chloroform*4)
↓ shake vigorously for 15sec.
↓ store for 2-3min. at room temperature
↓ 12K×g for 15min. at 4°C*5)
↓→→→→→interphase and organic phase*6)
↓（for subsequent isolation of DNA[protocol 2] and proteins[protocol 3] ）
↓
aqueous phase*7)
↓ add 0.5ml of isopropanol ( or 0.8 volume isopropanol)*5)
↓ store for 5-10min. at room temperature*8)
↓ 12K×g for 10min. at 4°C
precipitate*9)
↓ add at least 1ml of 75% ethanol
↓ vortex*10)
↓ 7.5K×g for 5min. at 4°C*11)
precipitate
↓ dry briefly*12)
↓ add ddH2O, TE(pH8.0) or 0.5% SDS
↓ dissolve
total RNA solution*7)*13)
*1）1.5mlプラスチックチューブを用いて処理する場合、組織や培養細胞等、試料の体積が100µl以下のものにはISOGEN、血液等、試料の体積が大きい(100µlを越える)ものにはISOGEN-LSが有効である。試料の体積が大きくても、濃縮により100µl以下にできる場合にはISOGENを使用することができる。
培養細胞などの試料の場合、培地などの水分は可能な限り除去する。
ISOGEN-LSを用いて液体試料を処理する場合、試料の容量が0.25ml以下の時には、水を加えて0.25mlにする。ISOGEN-LSと容量比が常に3：1になるようにする。血液や血清のように多くの成分が含まれる液体試料は、水で2倍に希釈してからISOGEN-LSを加える。*2）組織の場合は、ガラス・テフロンあるいはポリトロンホモジナイザーを用いてホモジナイゼーションする。また、培養皿に付着して増殖した細胞の場合には、10cm2当たり1mlのISOGENを直接加えてピペットで吸出して溶解する。細胞懸濁液の場合には遠心して沈殿させた後、5-10×106cells当たり1mlのISOGENを加えて同様にピペットで吸出して溶解する。筋、脂肪細胞、植物のようにタンパク質、脂質等などを多く含む試料の場合は、ホモジナイゼーション後に一度遠心(12K×g, 10min., 4°C)して、上清を以下の操作に用いる。この時脂肪は最上層に位置することに注意する。
*4）イソアミルアルコールの添加されたクロロホルムは使用できない。
*5）ホモジネートは、遠心分離により下層の有機相、中間層及び上層の水相にわかれる。RNAは水相に含まれるが、この水相にはDNAやタンパク質はほとんど含まれない。 この時の水相の体積は加えたISOGENの体積の約60%である。もし60％より少ない場合には、この後の操作で添加するisopropanol量は分取した水 相の体積に対して0.8倍容を添加する。30％以下の場合、組織量を減らすなどして、再度抽出し直すことを推奨する。
*6）ここで得られた中間相と有機相はそれぞれDNA及びタンパク質を単離するため、4°Cにて保存する。ただし、中間相や有機相中に多量の不溶物(カス状、繊維状のもの等)がある場合、DNA及びタンパク質の単離には適さない。
*7）DNAやタンパク質との夾雑を少なくすることによりRNAの回収率を上げるため、4中間相や有機相ができるだけ混入しないように、水相を新しいチューブに移して以下の操作を行う。ゲノムDNAのコンタミが予想される場合には新しいチューブに移した水相に等量のクロロホルムを加え、再抽出を行う。ポリサッカライド、プロテオグリカン、グリコーゲン等の夾雑物が含まれることが予想される場合、あるいは最終的に得られたRNAに含まれていることが確認された場合には、high-salt precipitation solution(1.2M NaCl, 0.8M sodium citrare, pH未調整)とイソプロパノールをそれぞれ水相の1/2容量加えてイソプロパノール沈殿を行い、10K×g, 15分遠心してRNAのみを沈殿させると効果的である。この後75%エタノールによる洗浄を行う。
RNA量が10µg以下の場合は、水相にEthachinmateを加えることにより、RNAの収率を上げることができる。*9）RNAの沈殿は、ゲル様のペレットとしてチューブの内壁と底に付着する。
*10）この状態で4°Cで少なくとも1週間、-20°Cであれば1年間は保存することができる。
*11）もしRNAの沈殿がチューブの内壁から流れ出しそうな状態の場合は、エタノール洗浄後の遠心は12K×gにて行う。
*12）RNAの沈殿は、風乾または5-10分間真空乾燥する。真空遠心機を用いて乾燥してはいけない。沈殿を完全に乾燥してしまうと溶解性が著しく減少する。溶解性が減少したRNAのOD260/OD280>は、1.6以下なので目安となる。得られたRNAは、滅菌蒸留水、TE(pH8.0)または0.5% SDSにピペットチップで吸出して溶解し、55-60°Cにて10-15分間保温すると良い。溶解する蒸留水、0.5% SDSは、あらかじめジエチルピロカーボネート(DEPC)処理によってRNaseフリーにしておくか、RNaseフリーグレードの市販品を用い ること。また、TE（pH8.0）を使用する場合は、RNaseフリーグレードの市販品を用いること（TEに含まれるTris-HClは、DEPC処理にて分解してしまうため）。
*13）得られたRNAをアガロースゲル電気泳動すると、主に約2kbと5kbのリボソームRNAのバンドの他に0.1-0.3kbの低分子RNAと、7-15kbの高分子RNAを観察することができる。得られたRNAのOD260/OD280は、1.6-1.8である。
[Code No./容量] [特長] [保存条件] [使用上の注意] [参考文献] [製品添付マニュアル] [ISOGEN法の原理] [プロトコール, トラブルシューティング] [使用例]