λ/Hind III(10ng/500µl)を0.1 mol/l酢酸ナトリウム存在下にて1 mlのエタノールを加え、沈殿させた回収DNAをアガロースゲル電気泳動した。
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λ/Hind III(10ng/500µl)を0.1 mol/l酢酸ナトリウム存在下にて1 mlのエタノールを加え、沈殿させた回収DNAをアガロースゲル電気泳動した。
- Lane 1 : λ/Hind III(control)
- Lane 2 : λ/Hind III＋Ethachinmate 3µl(ただちに遠心)
- Lane 3 : λ/Hind III−20°C, over night
- Lane 4 : λ/Hind III−80°C, 20分間
以上の結果から、0.1 mol/l酢酸ナトリウム存在下でEthachinmateを添加すると低温保存をしなくても微量DNAが定量的に回収できることがわかった。
(1) 制限酵素とT4 DNA Ligase
Ethachinmateの存在下で、λDNAを制限酵素とT4 DNA Ligaseを用いて切断-連結-再切断した。反応液は10µlあたり1µlのEthachinmateを含み、各酵素の反応条件は本誌記載の酵素反応条件に従った。
Enzyme Hae III Hind III Ethachinmate - + - + Result
- Lane 1 : 制限酵素による切断
- Lane 2 : T4 DNA Ligase による連結
- Lane 3 : 制限酵素による再切断
以上の結果から、制限酵素とT4 DNA Ligaseの反応は、Ethachinmate存在下でも影響を受けないことがわかった。
(2) 逆転写酵素
Ethachinmateの存在下で、AMV Reverse Transcriptase(RTase)を用いて、鋳型poly(rA)・(dT)12-8へ[3H]dTMPを取り込ませた。反応は50µl(50 mmol/l Tris-HCl(pH8.3), 6 mmol/l MgCl2, 40 mmol/l KCl, 0.5 mmol/l[3H]dTTP, 0.4 mmol/l poly(rA)・(dT)12-8, 5 units AMV RTase)、42°Cで行った。
RTase Ethachinmate
以上の結果から、AMV Reverse Transcriptaseによる合成反応は、Ethachinmate存在下でも影響を受けないことがわかった。
(3) Taq DNA Polymerase
Ethachinmateの存在下で、約600 bpのDNA領域をTaq DNA Polymeraseを用いて増幅した。 反応は、25µl(TAPS-HCl, pH9.3, 50 mmol/l KCl, 2 mmol/l MgCl2, 1 mmol/l 2-メルカプトエタノール, 0.01% ゼラチン, 200µ mol/l dNTPs, 0.2M プライマー, 1.25units Taq DNA Polymerase)で、94°C 1分間、55°C 2分間、72°C 1分間を25サイクル行った。
- Lane 1 : Ethachinmate 0 µl
- Lane 2 : Ethachinmate 0.2 µl
- Lane 3 : Ethachinmate 0.5 µl
- Lane 4 : Ethachinmate 1 µl
- Lane 5 : Ethachinmate 3 µl
- Lane 6 : Ethachinmate 5 µl
以上の結果から、Taq DNA Polymeraseによる合成反応は、Ethachinmate存在下でも影響を受けないことがわかった。
EthachinmateによるTransformation効率およびin vitro パッケージング効率への影響を以下のような方法で検討した。
(1) Transformation反応*1)
Competent E. coli JM 109(100µl)を氷中にて融解
↓←pBR322 DNA 0.1ng, Ethachinmate
氷中にて20分静置
↓
熱処理(水浴, 42°C, 45秒)後、氷中にて2分以上静置
↓
全量を400µlのHi-Competence Brothを含む試験管に移し、37°Cにて60分振とう
↓
LBプレート(100µg/ml：アンピシリン)に塗布し、37°Cにて一晩静置*1) ニッポンジーンTransformation Kit JM109(Code No. 319-01321)を使用した。
-形質転換効率への影響-(2) in vitro パッケージング反応*2)
Packaging Extract (Yellow tube)を氷中にて融解
↓←λDNA 0.2µg, Ethachinmate
室温(約22°C)にて1時間放置
↓
Phage Bufferを1 ml加え、穏やかに混合
↓
軽く遠心して残渣を落とした後上清をとって適当に希釈し、ファージのtiterを測定*2) ニッポンジーンIn vitro Packaging Kit LAMBDA INN(Code No. 317-01741)を使用した。
-in vitro パッケージング効率への影響-以上の結果から、Ethachinmateは、ニッポンジーンTransformation Kit JM109による大腸菌の形質転換に対して影響はないが、ニッポンジーンIn vitro Packaging Kit LAMBDA INNによるλファージのin vitro パッケージングに対して効率を若干低下させることがわかった。
Klenow Flagment、ランダムプライマー、[α-32P]dCTPを用いてλDNAの標識反応を行い、経時的にサンプリングし、12.5ng/mlになるように希釈後、その200µlに3 mol/l 酢酸ナトリウム 20µlおよびEthachinmate 2µlを加えてエタノール沈殿(Ethanol ppt.)して得られた沈殿の放射能を同量のトリクロロ酢酸不溶性沈殿(TCA ppt.)の放射能と比較した。
TCA ppt. Ethanol ppt. Ethachinmate Sodium Acetate 以上の結果から、上記条件で行ったエタノール沈殿が、TCA不溶性沈殿と同様の挙動を示したことから、塩存在下でのEthachinmate添加によりλDNAは定量的に回収され、DNA標識などにおける未反応のdNTPs除去に有効であることが示唆された。
Total RNA 150 µg(ISOGENで抽出)を用いて、Poly(A)+ RNAを精製した。エタノール沈殿により濃縮し、得られたPoly(A)+ RNAの収量を260 nmの吸光度を用いて測定した。
試料 Total RNA量 回収したPoly(A)+ RNA量 Ethachinmate : 有 Ethachinmate : 無
Ethachinmate が定量PCR の結果に影響を与えるかどうか確認した。
＜実験条件＞
18S rRNA Control Kit (FAM-TAMRA) （Eurogentec：RT-CKFT-18S）を使用し、以下の条件でReal-timePCR を行った。
＜結果＞
図1．Amplification plot（増幅曲線） ＜結論＞
Ethachinmate を添加した条件②および③とEthachinmate 未添加の条件①を比較したところ、得られたAmplification plot（図１）にはほぼ差が認められず、いずれのTemplate 濃度においても同様の増幅が確認された。また、各条件の検量線の傾き（図2）もほぼ同じと判断された。条件③は、PCR 反応液（20μL）にEthachinmate 1μl を添加しており、通常想定されるEthachinmate の使用方法から考えると、持ち込み量が極めて多い条件となっている。この条件③においても、条件①との傾きの差は極めて小さかった。
以上の結果から、鋳型となる核酸の精製にEthachinmate を使用した場合においても、Real-time PCRに与える影響は極めて少ないか、ほとんどないと考えられる。また、条件①と②の差がほとんどないことから、Ethachinmate による効率の良い核酸回収能力も確認された。
[容量・Code No.] [特長] [使用方法] [Q&A] [実験例]
