| Lane | Sample | Lane | Sample |
| 1 | AT(control) | 8 | AG mismatch |
| 2 | 1 塩基欠失 | 9 | TT mismatch |
| 3 | 2 塩基欠失 | 10 | AC mismatch |
| 4 | 3 塩基欠失 | 11 | AA mismatch |
| 5 | 4 塩基欠失 | 12 | CC mismatch |
| 6 | GT mismatch | 13 | GG mismatch |
| 7 | CT mismatch | 14 | AA mismatch |
SYBR ® Gold染色
1〜4塩基の欠失(Lane 2〜5)及び8種類のミスマッチ(Lane 6〜13)に対するTaq MutSの結合活性の違いを見るため、基質100ngに反応バッファ−とTaq MutS 1ugを加え、65°Cで30分間反応させた。反応後、電気泳動により基質特異性を確認した。
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| 6% 未変性ポリアクリルアミドゲル SYBR ® Gold染色 |
ニトロセルロ−スフィルタ−上にTaq MutS 500ngを固定した後、ビオチンラベルした36bpの合成DNA100ngをフィルタ−上で反応させた。ビオチンに対してストレプトアビジン-アルカリホスファタ−ゼ複合体を結合させ、発光基質を用いてX線フィルムで検出した。その結果、1〜3塩基欠失及びAG, CT, GTのミスマッチに特異的に結合した。
正常な配列(N:normal)に対して2塩基の欠失を生じた変異配列(M:mutant)を持つプラスミドを作製した。鋳型として、NまたはMのみを用いたものとNとMを混ぜたものを用いて各々PCRを行った。PCR終了後、変性とアニ−リングを行い、直接Taq MutS(1ug)を加えて65°Cにて30分間反応させ、電気泳動を行った。(下図参照)PCRで増幅する長さを60bp, 100bp, 200bpの3種類で行った結果、それぞれにおいて欠失部位が検出できた。
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4〜10%未変性ポリアクリルアミドゲル SYBR ® Gold染色 |
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